心力衰竭大鼠心肌細(xì)胞凋亡與心肌纖維化的相關(guān)性

盧小偉，馬珍珍

心力衰竭是由包括炎癥反應(yīng)在內(nèi)的復(fù)雜病理生理學(xué)機(jī)制造成的臨床綜合征，其發(fā)病機(jī)制是多方面原因共同作用的結(jié)果[1]。心力衰竭可導(dǎo)致機(jī)體心排血量減少，使心率增快、心肌收縮力加強(qiáng)，激活交感神經(jīng)系統(tǒng)，又會(huì)增加心肌耗氧量、減弱心肌收縮力，造成腎素-血管緊張素系統(tǒng)激活，使心肌負(fù)荷過重，并促進(jìn)交感神經(jīng)興奮，增加去甲腎上腺素的釋放，從而形成惡性循環(huán)[2-3]。心力衰竭病人中存在心肌細(xì)胞進(jìn)行性缺失，細(xì)胞凋亡參與了心力衰竭的發(fā)病過程[4]。凋亡是由體內(nèi)外因素觸發(fā)細(xì)胞內(nèi)預(yù)存的死亡程序而導(dǎo)致的細(xì)胞主動(dòng)性死亡方式，也是活體內(nèi)個(gè)別細(xì)胞程序性細(xì)胞死亡的表現(xiàn)形式[5-6]。心肌細(xì)胞減少多是心肌細(xì)胞凋亡所致，是造成心肌功能障礙最為關(guān)鍵的因素[7]。細(xì)胞外基質(zhì)與心肌細(xì)胞的變化屬于心力衰竭機(jī)體心室重塑的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)，前者的變化主要是間質(zhì)纖維化，后者主要包括了心肌細(xì)胞喪失[8-9]。心肌纖維化包括間質(zhì)纖維化和心肌間質(zhì)膠原沉積，屬于多種不同的心臟疾病發(fā)展到一定時(shí)期時(shí)的一個(gè)共同病理改變[10-11]。本研究探討了心力衰竭大鼠心肌細(xì)胞凋亡與心肌纖維化的相關(guān)性，希望明確心力衰竭發(fā)生的機(jī)制。現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 雄性SD大鼠18只，由北京市華阜康生物科技股份有限公司，體重(200±10)g，在某醫(yī)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心的清潔級(jí)動(dòng)物房飼養(yǎng)，購(gòu)買后在動(dòng)物房中飼養(yǎng)1周進(jìn)行適應(yīng)，標(biāo)準(zhǔn)飼養(yǎng)方式，飼養(yǎng)明暗環(huán)境各12 h交替，室溫20～25 ℃，相對(duì)濕度40%～60%。

1.2 動(dòng)物分組與處理 將大鼠隨機(jī)分為兩組，每組9只。模型組：腹腔注射阿霉素，建立心力衰竭模型，第1 天2 mg/kg，第4 天開始給予3 mg/kg，每周1次，時(shí)長(zhǎng)為4周，累計(jì)劑量達(dá)到20 mg/kg。造模成功標(biāo)準(zhǔn)：實(shí)驗(yàn)后超聲心動(dòng)圖測(cè)定大鼠左室射血分?jǐn)?shù)≤35%。空白對(duì)照組：腹腔注射液與阿霉素等體積生理鹽水。

1.3 觀察指標(biāo) ①實(shí)驗(yàn)環(huán)節(jié)定期觀察大鼠的進(jìn)食、腹水等。②所有大鼠在實(shí)驗(yàn)后于腹主動(dòng)脈取1 mL血，靜置于37 ℃的水浴0.5 h，取上層血清，采用雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法(ELISA)檢測(cè)腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白細(xì)胞介素-6(IL-6)的含量。③取血完畢后取大鼠的心臟組織，取左室縱截面心肌組織，常規(guī)固定、包埋和制片，選擇Digital Imaging System醫(yī)學(xué)圖像分析系統(tǒng)，測(cè)量心肌纖維化相關(guān)指標(biāo)，包括心肌血管周圍膠原與管腔面積比例(PVCA)、左心室重量指數(shù)(LVMI)、心肌膠原體積比例(CVF)等指標(biāo)，每張心肌切片標(biāo)本均隨機(jī)取4個(gè)視野測(cè)量，取平均值。④取心肌切片組織，免疫組化法檢測(cè)心肌Caspase-8、Bcl-2蛋白表達(dá)情況。切片經(jīng)常規(guī)二甲苯脫蠟、梯度酒精水化后進(jìn)行抗原修復(fù)，使用山羊血清進(jìn)行室溫孵育封閉30 min，在標(biāo)本上滴加一抗：兔抗大鼠Bcl-2多克隆抗體(1∶250)、兔抗大鼠Caspase-8多克隆抗體(1∶100)，4 ℃濕盒中過夜后，沖洗后滴加生物素標(biāo)記物二抗(即用型鏈霉親和素辣根過氧化物酶)，在室溫狀態(tài)下進(jìn)行孵育0.5 h，二甲基聯(lián)苯胺(DAB)顯示，通過磷酸鹽緩沖液(PBS)進(jìn)行3次沖洗，光鏡下記錄與計(jì)算積分光密度值(integral optic density，IOD)，IOD值越大，表明Caspase-8、Bcl-2蛋白表達(dá)越強(qiáng)。

2 結(jié) 果

2.1 一般狀況 所有大鼠在實(shí)驗(yàn)中都存活，空白對(duì)照組大鼠進(jìn)食、運(yùn)動(dòng)正常，皮毛整潔，體重穩(wěn)定增長(zhǎng)；模型組大鼠均建模成功，均出現(xiàn)脫水、進(jìn)食少、體重下降等狀況。

2.2 兩組血清炎性因子表達(dá)水平比較 與空白對(duì)照組相比，模型組血清IL-6、TNF-α水平增加(P<0.05)。詳見表1。

表1 兩組血清炎性因子表達(dá)水平比較 (±s) 單位：pg/mL

2.3 兩組心肌纖維化指標(biāo)水平比較 模型組的LVMI、CVF、PVCA均高于空白對(duì)照組(P<0.05)。詳見表2。

表2 兩組心肌纖維化指標(biāo)水平比較(±s)

2.4 兩組心肌組織Caspase-8、Bcl-2蛋白表達(dá)水平比較 模型組心肌組織Caspase-8、Bcl-2蛋白相對(duì)表達(dá)量高于空白對(duì)照組(P<0.05)。詳見表3。

表3 兩組心肌組織Caspase-8、Bcl-2蛋白表達(dá)水平比較 (IOD值，±s)

2.5 相關(guān)性分析 在模型組大鼠中，直線相關(guān)分析顯示，心肌組織Caspase-8、Bcl-2蛋白相對(duì)表達(dá)量與LVMI、CVF、PVCA呈正相關(guān)性(P<0.05)。詳見表4。

表4 心力衰竭大鼠心肌細(xì)胞凋亡與心肌纖維化的相關(guān)性

3 討 論

本研究結(jié)果顯示，相比空白對(duì)照組，模型組血清IL-6、TNF-α含量明顯增加(P<0.05)，表明心力衰竭大鼠可能通過炎性因子介導(dǎo)某種機(jī)制引起心肌損傷，從而導(dǎo)致心功能下降。TNF-α可誘導(dǎo)活性氧的產(chǎn)生，也可降低心肌收縮力，導(dǎo)致內(nèi)皮細(xì)胞和心肌功能障礙。并且TNF-α還可激活活性B細(xì)胞的核因子-κB (NF-κB)，從而導(dǎo)致中性粒細(xì)胞遷移、炎性細(xì)胞因子的產(chǎn)生[12-14]。基礎(chǔ)研究顯示，TNF-α可通過時(shí)間-依賴的方式影響心肌重塑，且其高表達(dá)與心臟局部血管緊張素的活性相關(guān)。IL-6與心力衰竭病人病情的嚴(yán)重程度、預(yù)后相關(guān)，其能在心肌細(xì)胞和成纖維細(xì)胞之間傳遞信號(hào)[15-16]。

心臟慢性壓力負(fù)荷過重時(shí)，心肌細(xì)胞數(shù)量降低是造成心肌功能障礙的關(guān)鍵因素，其中心肌細(xì)胞數(shù)目減少的主要原因是心肌細(xì)胞凋亡[17]。細(xì)胞凋亡是復(fù)雜多變的一個(gè)病理生理過程，多種不同因素可對(duì)其產(chǎn)生影響。在心力衰竭中對(duì)細(xì)胞凋亡具有調(diào)控作用的基因主要為Caspase-8、Bcl-2等[18]。Caspase-8、Bcl-2間通過相互形成純或雜二聚體達(dá)成動(dòng)態(tài)平衡，當(dāng)其表達(dá)上升時(shí)，決定了細(xì)胞在受到凋亡信號(hào)刺激時(shí)可發(fā)生凋亡。也有研究顯示，心力衰竭時(shí)Bcl-2的水平未發(fā)生顯著改變，而Caspase-8/Bcl-2的比值發(fā)生了改變，說明Bcl-2對(duì)心肌細(xì)胞凋亡無顯著影響[19]。本研究顯示，模型組心肌組織Caspase-8、Bcl-2蛋白相對(duì)表達(dá)量高于空白對(duì)照組(P<0.05)。從機(jī)制上分析，Caspase-8、Bcl-2蛋白的高表達(dá)可抑制線粒體釋放細(xì)胞色素C，也可改變離子通道蛋白通透性與抑制鈣離子跨膜流動(dòng)，從而誘導(dǎo)心肌細(xì)胞發(fā)生凋亡[20-21]。

心肌纖維化能降低心室功能，減少冠狀動(dòng)脈灌注儲(chǔ)備，誘發(fā)室性心律失常。特別是心肌中膠原沉積增加心臟舒張期僵硬度，可能影響心肌收縮力，進(jìn)一步增加膠原含量，從而損害心臟功能。心肌纖維化也可進(jìn)一步激活神經(jīng)內(nèi)分泌因子的表達(dá)，而心力衰竭時(shí)神經(jīng)內(nèi)分泌細(xì)胞因子等的激活是心力衰竭惡化的重要原因[22]。本研究結(jié)果顯示，模型組LVMI、CVF、PVCA均高于空白對(duì)照組(P<0.05)。LVMI、CVF、PVCA被認(rèn)為是與心功能關(guān)系最為密切的心肌纖維化指標(biāo)，LVMI、CVF、PVCA部分增加只能影響舒張期僵硬度，但是增加幅度過高就會(huì)降低心臟收縮力[23]。

心力衰竭是進(jìn)行性的一種病變，在心力衰竭不斷發(fā)展過程中多種分子和細(xì)胞機(jī)制導(dǎo)致心肌結(jié)構(gòu)發(fā)生變化。特別是在擴(kuò)張型心肌病的心肌細(xì)胞中也可以檢測(cè)出凋亡細(xì)胞，然而細(xì)胞凋亡在心力衰竭中所起的作用還不明確[24]。本研究直線相關(guān)分析顯示，心力衰竭大鼠心肌組織Caspase-8、Bcl-2蛋白相對(duì)表達(dá)量與LVMI、CVF、PVCA均呈正相關(guān)(P<0.05)。當(dāng)前也有研究顯示，心肌細(xì)胞在心臟慢性壓力負(fù)荷過重時(shí)心肌組織纖維化和細(xì)胞數(shù)量降低，是造成心肌功能障礙的關(guān)鍵因素[25]。本研究也有一定的不足，取樣的時(shí)間點(diǎn)達(dá)不到要求，無法在整個(gè)心力衰竭過程中評(píng)價(jià)心肌細(xì)胞凋亡與心肌纖維化水平，且樣本數(shù)量較少，將在后續(xù)研究中進(jìn)行深入分析。

綜上所述，心力衰竭大鼠伴隨有心肌細(xì)胞凋亡增加與心肌纖維化，并表現(xiàn)為炎性因子的過量表達(dá)，心肌細(xì)胞凋亡與心肌纖維化可相互影響，從而影響心力衰竭的發(fā)生發(fā)展。