蒙古族與漢族高血壓病人內皮細胞miRNA表達譜差異分析

姜海濤，代玉靜，魏 瑋，孫顯東，徐艷慧，李 強，楊華志，斯欽孟和，王衛芳

高血壓是多種心腦血管疾病的重要危險因素[1]。有研究發現，內蒙古地區蒙古族居民的高血壓患病率較同地區的漢族居民高，可能與兩個民族居民的飲食、生活習慣差異有關，但具體的生物學機制尚不清楚[2]。微小RAN(microRNA，miRNA)屬調控性非編碼RNA，為一類由內源基因編碼單鏈RNA分子，其長度約為19～23個核苷酸，可參與動植物生命活動中轉錄后水平的基因表達調控。有研究發現，高血壓的發生與miRNA的調控有密切關系[3]。而內蒙古地區蒙古族居民與同地區的漢族高血壓病人血管內皮細胞miRNA表達譜是否存在差異報道較少。本研究旨在通過比較內蒙古地區蒙古族和漢族高血壓病人血管內皮細胞miRNA表達譜，探討兩個民族居民高血壓發病率差異的生物學機制。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 將2017年9月—2018年9月赤峰市醫院、錫林郭勒盟醫院、海拉爾區人民醫院就診的128例蒙古族原發性高血壓病人作為觀察組，其中男74例，女54例；將136例漢族原發性高血壓病人作為對照組，其中男76例，女60例。研究對象的血壓依據《中國高血壓防治指南2010》所制定的標準測量方法進行測量，以兩次測量結果的平均值作為最后的血壓值。其中高血壓診斷及分級標準為：在未用抗高血壓藥情況下，收縮壓(SBP)≥140 mmHg(1 mmHg=0.133 kPa)和(或)舒張壓(DBP)≥90 mmHg，或既往有高血壓史，目前正在用抗高血壓藥者，即診斷為高血壓[4]。正常血壓高值：SBP 120～139 mmHg和(或)DBP 80～89 mmHg；1級高血壓：SBP 140～159 mmHg和(或)DBP 90～99 mmHg；2級高血壓：SBP 160～179 mmHg和(或)DBP 100～109 mmHg；3級高血壓：SBP≥180 mmHg和(或)DBP≥110 mmHg。排除標準：繼發性高血壓、心功能Ⅲ～Ⅳ級、冠心病、重度肺功能不全、風濕性疾病、糖尿病、內分泌紊亂、嚴重肝腎功能異常、腦卒中、外周動脈疾病、精神疾病以及妊娠或哺乳期女性。研究對象均簽訂知情同意書。

1.2 質量控制 依據《中國高血壓基層管理指南(2014年修訂版)》的方法對項目組成員進行問卷調查和血壓測量操作的專項培訓，并設專人對樣本收集過程進行質量監督。對所得數據進行雙錄入，兩次錄入結果經計算機檢錯，錄入正確率為99.9%。

1.3 方法

1.3.1 外周血總RNA提取和質量檢測 兩組病人均于清晨抽取空腹外周靜脈血(10 mL)，置于乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝管內，分裝后-80 ℃保存備用。按250 μL血液加750 μL Trizol RNA提取液的比例混合，裂解5 min后，加入200 μL氯仿，室溫靜置3 min后，4 ℃、12 000 r/min離心15 min；取上清液，加入500 μL異丙醇，靜置過夜后(-20 ℃)、4 ℃、12 000 r/min離心15 min；棄上清，用80%的焦碳酸二乙酯(DEPC)乙醇洗滌總RNA，4 ℃、7 500 r/min離心5 min，棄上清，自然風干RNA沉淀。加雙蒸水溶解總RNA，采用NanoDrop風光光度計和Agilent 2100生物芯片分析系統檢測樣品總RNA的A260/A280值，介于1.7～2.2且28S/18S>0.7，表明總RNA樣品的質量合格。液氮中保存備用。

1.3.2 miRNA反轉錄 利用TaqMan MIRNA Reverse Transeription Kit和帶莖環結構的miRNAs特異RT-primer進行miRNA反轉錄。miRNA反轉錄試劑盒進行RNA反轉錄，得到的cDNA采用miRNA熒光定量PCR試劑盒進行 RNA定量，miRNAs反轉錄反應體系為15 μL：dNTPs(100 mmol/L)0.15 μL、反轉錄酶(50 U/μL)1 μL、10×Buffer 1.5 μL、酶抑制劑(20 U/μL)0.019 L，無 RNA 酶純水 4.16 μL，每15 μL RT reaction體系包含7 μL RT master mix、5 μL total RNA (1 to 10 ng per reaction)，離心后置于冰上孵育 5 min 進行反轉錄反應，16 ℃、30 min，42 ℃、30 min，85 ℃、5 min，4 ℃保存。 miRNA的定量檢測：利用實時熒光定量聚合酶鏈反應(qRT-PCR)方法，定量檢測血漿中miRNAs表達。qRT-PCR反應條件：95 ℃、10 min，95 ℃、15 s，60 ℃、60 s，40個循環，組內重復3次取平均值。通過優化提取、反轉錄及定量檢測方法，建立穩定、可靠的血漿miRNAs定量檢測方法。

1.3.3 基因芯片檢測不同樣品中miRNA表達譜差異 總RNA進行Poly(A)加尾，根據生物標記試劑盒說明書，將生物素標記的信號分子與總RNA相連接。在室溫條件下，取雜交液81.7 μL與經生物素標記的總RNA樣品混勻，并按說明書進行處理后，加入miRNA芯片中，于雜交爐內恒溫(48 ℃)雜交16 h。結束后棄雜交液，芯片加入緩沖液沖洗，待芯片干燥后進行掃描。掃描圖像經Affymetrix GeneChip Command Consolies 1.1軟件進行數據分析，并結合相關文獻報道[5]，篩選兩組芯片中與高血壓相關的差異表達miRNAs，篩選標準為：Cy3、Cy5信號值均>200，Cy3或Cy5信號值>800，差異倍數在2倍以上，且P<0.05。

2 結 果

2.1 兩組臨床資料比較 兩組年齡、性別、血脂指標、肌酸(Cr)、體質指數(BMI)、2型糖尿病、紅細胞計數、血小板計數等臨床資料比較，差異均無統計學意義(P>0.05)。詳見表1。

表1 兩組臨床資料比較

2.2 miRNA濃度及純度的檢測 蒙古族和漢族高血壓病人血液總RNA的A260/A280值分別為2.24和2.31，總RNA的濃度分別為287 ng/μL和296.9 ng/μL，28S/18S比值分別為1.69和1.81。表明上述樣品所提取總RNA的質量符合芯片檢測要求，可以確保后續實驗的開展。

2.3 兩組樣本表達譜miRNA基因芯片結果 miRNA基因芯片共檢測2 812個miRNA。觀察組與對照組相比，篩選獲得20個差異表達較劇烈的miRNA，其中上調表達12個，下調表達8個。上調表達的miRNA多于下調表達的miRNA 。詳見表2、表3。

2.4 逆轉錄cDNA質量的檢測 cDNA定量：取混勻的cDNA樣本1 μL，用分光光度儀分別測定260 nm、280 nm的吸光值。根據A260/A280估計核酸純度及濃度，均符合實驗要求。

2.5 兩組miRNA相對表達水平比較 提取兩組血漿中的RNA，運用hsa-miR-132、hsa-miR-192、hsa-miR-212、hsa-miR-361-5p、hsa-miR-17、hsa-miR-30、hsa-miR-72、hsa-miR-144、hsa-miR-150、hsa-miR-638、hsa-miR-1249、hsa-miR-185和hsa-miR-155、hsa-miR-27b、hsa-miR-149、hsa-miR-296-5p、hsa-miR-133b、hsa-miR-1825、hsa-miR-1280、hsa-miR-150分子末端加 poly(A)尾法進行逆轉錄，再用 SYBRGreen法進行qRT-PCR，核小分子RNA U6(RNU6)作為內參。計算2-△△T后，通過兩組比較t檢驗分析，差異有統計學意義(P均<0.01)。

2.6 兩組血液miRNA表達譜差異檢測結果 經基因芯片檢測，與漢族高血壓病人相比，蒙古族高血壓病人血液中，上調的與高血壓相關的miRNAs有12個，其中miRNA-132上調倍數最大(29.33倍)，詳見表2；而下調的與高血壓相關的miRNAs有8個，miRNA-155下調倍數最大(14.12倍)，詳見表3。分別對上述差異表達miRNA的靶基因進行京都基因與基因組百科全書(KEGG)富集分析，結果顯示，上述miRNA主要參與凋亡信號通路(主要為p53)、轉化生長因子-β(transforming growth factor-β，TGF-β)信號轉導通路、血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)信號轉導通路、Wnt信號轉導通路、絲裂原活化蛋白激酶(mitogen activated protein kinases，MAPK)信號轉導通路、mTOR信號轉導通路、Jak-STAT信號轉導通路以及細胞骨架信號通路等。

表2 兩組血液miRNA表達譜差異檢測結果(上調倍數)

表3 兩組血液miRNA表達譜差異檢測結果(下調倍數)

2.7 高血壓不同亞組miRNA表達水平比較 高血壓病人分為3個亞組：1級高血壓組、2級高血壓組、3級高血壓組，3組年齡、高血脂史、糖尿病史、高血壓史、冠心病家族史、BMI、TC、TG、HDL-C、載脂蛋白A1(Apo-A1)、血同型半胱氨酸(Hcy)、血清總膽紅素(TBIL)、纖維蛋白原(FIB)比較差異均無統計學意義(P>0.05)。3級高血壓組miRNA表達上調或下調倍數高于2級高血壓組，2級高血壓組高于1級高血壓組(P<0.05)，差異均有統計學意義。其中，miRNA-132、miRNA-192、miRNA-212、miRNA-361-5p、miRNA-17、miRNA-155、miRNA-27b的特異度和敏感度較高，可作為蒙古族高血壓病人與漢族高血壓病人差異的標記物。

3 討 論

miRNA的生物學作用機制一般為與靶mRNA的互補區域結合后，可以負性調控靶mRNA的翻譯水平(或者直接將靶mRNA降解)，從而負性調控靶基因的轉錄和表達。一般情況下，一個miRNA可以調控多個靶基因，而一個靶基因又可以受到多個miRNA的負性調控，從而構成一個復雜的生物學調控網絡。研究表明，高血壓的發病具有多環節、多靶點的特點，涉及腎素-血管緊張素-醛固酮系統(renin-angiotensin-aldosterone system，RAAS)的功能、血管內皮細胞及平滑肌細胞的功能及其細胞膜電離子通道的數量及功能等，并且上述各靶點均可與有相關的miRNA參與調控[6-9]。同時，研究發現機體的組織和細胞產生的miRNAs在參與高血壓的發病過程中，可以進入血液循環，并在血液中被檢測到。由于這些miRNAs均以某種穩定的形式存在，從而不會被血液中的RNA酶所降解。因此，這些參與高血壓發病的miRNAs不僅可以作為早期診斷高血壓病的生物學指標，同時也可以作為治療高血壓病的靶點[10]。

miRNA芯片檢測技術是通過計算機掃描處理和定量分析芯片的高密度雜交點陣圖象，從而得到miRNA差異表達譜，具有高通量、高靈敏性、高度可重復性以及生物檢材需求量低等特點，已經廣泛應用于包括高血壓病在內的多種疾病發病機制及藥物干預的研究中。本研究借助miRNA芯片檢測技術的優勢，成功篩查出內蒙古地區蒙古族高血壓病人和漢族高血壓病人差異表達的高血壓病相關miRNA 20個。蒙古族高血壓病人血液中hsa-miR-132、hsa-miR-192、hsa-miR-212、hsa-miR-361-5p、hsa-miR-17、hsa-miR-30、hsa-miR-72、hsa-miR-144、hsa-miR-150、hsa-miR-638、hsa-miR-1249和hsa-miR-185表達上調，hsa-miR-155、hsa-miR-27b、hsa-miR-149、hsa-miR-296-5p、hsa-miR-133b、hsa-miR-1825、hsa-miR-1280、hsa-miR-150表達下調。差異表達量與高血壓分級有關，即分級越高，上調或下調越大，3級高血壓最明顯。根據對miRNA的靶基因進行KEGG富集分析，結果顯示，內蒙古地區蒙古族居民和漢族居民的高血壓患病率差異可能與凋亡信號通路(主要為p53)、TGF-β信號轉導通路、VEGF信號轉導通路、Wnt信號轉導通路、MAPK信號轉導通路、mTOR信號轉導通路、Jak-STAT信號轉導通路以及細胞骨架信號通路等有關。表明由于受到遺傳因素以及飲食因素的影響，上述20個miRNAs在內蒙古地區的蒙古族居民和漢族居民體內存在差異表達，從而造成包括凋亡信號通路(主要為p53)、TGF-β信號轉導通路等上述信號轉導通路的生物活性在兩個民族的居民體內存在差異，而這些信號轉導通路均與高血壓的發病存在密切相關關系，從而導致同一地區兩個民族的居民在高血壓病的發病比例上存在明顯差異[2，5]。

本研究結果提示，上述20個miRNAs在內蒙古地區的蒙古族居民和漢族居民體內存在差異表達，并參與差異調控多條信號轉導通路的活性，最終導致同一地區兩個民族的居民高血壓發病率存在明顯差異。因此，上述20個miRNAs有可能作為早期診斷內蒙古地區蒙古族居民高血壓病的生物學指標。但至于上述哪些miRNAs可以作為內蒙古地區蒙古族居民高血壓病治療的關鍵靶點，還有待于進一步研究。