小泛素樣修飾物蛋白酶3 調控小鼠肺泡Ⅱ型上皮細胞自噬

朱慧琴，鄒嫣瓊，楊 潔，易 靜，楊 潔

(1. 上海交通大學醫學院生物化學與分子細胞生物學系，上海 200025；2. 上海交通大學醫學院基礎醫學公共技術平臺，上海 200025)

細胞自噬（autophagy）是細胞內高度保守的生命活動現象之一，是細胞適應環境變化、維持內環境穩定的重要機制[1]。因自噬程度與應激時細胞是否能夠適應而生存或適應不良而死亡的命運有關，故自噬程度的調控對細胞乃至機體均有重要意義。細胞自噬程度的控制主要通過在基因轉錄、轉錄后和翻譯后水平上調控自噬相關蛋白的表達量和相互作用而實現[2-4]，其中可逆的蛋白質翻譯后修飾能夠快速調控自噬相關信號轉導蛋白，因而是重要的自噬調控方式。目前研究已發現，磷酸化、泛素化和乙酰化修飾在自噬中具有重要作用，但小泛素樣修飾物（small ubiquitinlike modifier，SUMO）化修飾在動物體內是否存在調控作用的相關研究報道較少[5]。

與泛素化修飾類似，SUMO 與底物蛋白質的賴氨酸共價連接的過程被稱為SUM O 化修飾（SUMOylation），SUMO 特異性蛋白酶（SUMOspecific protease，SENP）家族則介導可逆的去SUMO 化修飾（de-SUMOylation），共同影響蛋白質的結構、定位及活性[6-8]。本研究組長期關注SENP 家族的SENP3，發現其在細胞應激應答中具有重要功能[9-13]；研究還發現，在體外培養細胞和小鼠體內經典的營養缺乏或饑餓應激可以誘導肝細胞自噬，且自噬相關重要蛋白質卷曲螺旋狀Myosin 樣Bcl-2 相互作用蛋白1（coiled-coil myosin-like Bcl-2-interacting protein 1，BECN1）發生了SUMO化修飾，而小鼠肝細胞中SENP3基因被特異性敲除后SUMO化修飾程度增強并導致自噬水平升高，提示自噬發生時SENP3 介導了BECN1的去SUMO化修飾，并且對自噬程度進行精細調控[14]。然而，在其他組織中SENP3 是否具有調控自噬的功能，底物蛋白質是什么，目前均不清楚。一些研究初步表明，自噬參與調節肺的炎性反應，影響肺損傷的程度[15-16]。但因為動物在體水平的自噬不易被檢測，調控自噬的研究也很少，故目前對靜息時肺組織是否存在自噬，以及饑餓等生理刺激時自噬是否發生，肺的上皮細胞、內皮細胞、間質細胞和炎性細胞中哪種細胞類型發生自噬，SENP3 是否調控自噬程度等，這些問題均少見報道。

本研究利用基因敲除雜合子（SENP3+/—）小鼠，比較饑餓后肺組織細胞自噬水平，以期認識和發現在體水平的自噬以及SENP3對自噬的調節作用。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

SENP3 基因敲除雜合子（SENP3+/－）小鼠由上海交通大學基礎醫學院生物化學與分子細胞生物學系程金科教授惠贈。S E N P 3 野生型（SENP3+/+）即背景品系SPF 級C57BL/6J 小鼠購自上海靈暢生物科技有限公司[S C X K（滬）2018-0003]，飼養于SPF 級環境[SYXK（滬 ）2018-0027]。本實驗經上海交通大學醫學院動物福利倫理委員會批準（編號為A-2019-041）。

1.2 主要試劑與儀器

抗SENP3 抗體、抗微管相關蛋白1A/1B-輕鏈3（microtubule-associated protein 1A/1B-light chain 3，LC3）抗體、抗SUMO2/3 抗體、抗BECN1 抗體和IgG 抗體均購自美國CST公司；抗β-actin 抗體、氯喹及N- 乙基馬來酰胺（Nethylmaleimide，NEM）均購自美國Sigma 公司；抗表面活性物質相關蛋白C（surfactant protein C，SP-C）抗體購自英國Abcam 公司；辣根過氧化物酶標記的二抗購自美國Jackson ImmunoResearch 公司；熒光標記二抗購自美國Invitrogen 公司；放射免疫沉淀法（radio immunoprecipitation assay，RIPA）蛋白裂解液購自美國Thermo Fisher 公司。

蛋白質免疫印跡（Immunoblotting）裝置購自美國Bio-Rad 公司；透射電子顯微鏡購自日本Hitachi 公司；激光掃描共聚焦顯微鏡購自德國Zeiss 公司。

1.3 建立小鼠自噬誘導及干預模型

8 周齡雄性SENP3+/+小鼠16 只和SENP3+/-小鼠16 只，分別隨機分為對照組、饑餓組、溶酶體抑制劑氯喹組和饑餓合并氯喹組。對照組為正常飲食；饑餓組小鼠禁食40 h，不斷水[14,17]；氯喹組為腹腔注射氯喹（60 mg/kg）；饑餓合并氯喹處理組為饑餓處理前2 h 腹腔注射氯喹（60 mg/kg），間隔20 h 再注射1次，饑餓時間為40 h。氯喹可抑制溶酶體功能，用來區分自噬的發生或溶酶體降解功能的異常，從而評估自噬流。上述處理結束后以脊椎脫臼法處死小鼠，取雙側肺組織，將肺葉剪開，部分切為小塊，分別置于液氮和固定劑中，準備用于蛋白質檢測、免疫組織化學染色和電子顯微鏡觀察。

1.4 免疫熒光技術檢測小鼠肺組織細胞中SENP3的定位及細胞自噬

取肺組織，用質量分數為4%的多聚甲醛溶液固定，30% 蔗糖溶液脫水，冰凍切片包埋劑（optimal cutting temperature compound，OCT）包埋，冷凍切片機切片，厚度為5 μ m。封閉1 h，加入抗SENP3 抗體（工作液體積稀釋比例為1 ∶100）以及抗SP-C 抗體（稀釋比例為1∶200），4 ℃孵育過夜；然后加入熒光標記二抗（稀釋比例為1∶1000），37 ℃孵育1 h。漂洗后用4',6- 二脒基-2- 苯基吲哚（4',6-diamidino-2-phenylindole，DAPI）（稀釋比例為1∶2000）對比染色，抗淬滅劑封固，激光掃描共聚焦顯微鏡下拍攝，通過ZEN圖像成像軟件輸出圖片。

應用LC3 免疫熒光染色法檢測細胞自噬，肺組織冰凍切片用LC3 抗體（稀釋比例為1∶100）孵育，4 ℃過夜，其他步驟同前。LC3-Ⅰ彌散分布于細胞質，而 LC3-Ⅱ形成后分布于自噬小體膜或自噬溶酶體膜，呈現為斑點狀（dots），故以點狀LC3 的出現指示自噬的發生。

1.5 免疫印跡法檢測小鼠肺組織中相關蛋白表達水平和細胞自噬水平

取0.1 g 肺組織，加入含有蛋白酶抑制劑的RIPA 蛋白裂解液，研磨并超聲提取肺組織蛋白，并用BCA 試劑盒檢測蛋白質濃度。按每孔20 μg 上樣，通過十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白，并轉移至聚偏二氟乙烯膜，脫脂奶粉封閉1 h。分別加入抗SEN P3、LC3、BECN1 和SUMO2/3 抗體（稀釋比例為1∶1000），以及抗β-actin 抗體（稀釋比例為1∶5000），孵育過夜，再加入二抗（稀釋比例為1∶5000），37 ℃孵育1 h，試劑盒顯影，化學發光成像儀檢測并輸出圖片。

因細胞自噬時LC3- Ⅰ與磷脂酰乙醇胺（phosphatidyl ethanolamine，PE）結合后轉變為LC3-Ⅱ ，故應用抗LC3 抗體進行免疫印跡可檢測細胞自噬。LC3-Ⅰ轉化為LC3-Ⅱ提示細胞自噬啟動，LC3- Ⅱ的量反映自噬水平。

1.6 透射電子顯微鏡觀察小鼠肺組織自噬情況

肺組織置于2.5%戊二醛固定液中，4 ℃固定48 h，1%鋨酸固定2 h，梯度乙醇溶液脫水后環氧丙烷置換，812 包埋劑浸透，60 ℃烘箱聚合48 h。超薄切片機切90 nm 厚度的肺組織切片，檸檬酸鉛染色，透射電子顯微鏡下觀察肺組織自噬細胞形態。

1.7 免疫共沉淀技術檢測小鼠肺組織中BECN1的SUMO化修飾

取0.1 g 肺組織，加入含有蛋白酶抑制劑和NEM 的RIPA 蛋白裂解液 1 mL，研磨并超聲，14000×g，4 ℃離心15 min 后吸取上清蛋白樣品。留取60 μL 樣品作為對照，其余樣品中加入抗BEC N1 抗體，4 ℃旋轉過夜。加入40 μ L Protein A/G 瓊脂糖珠子，4 ℃旋轉過夜，漂洗后加50 μL 上樣緩沖液，100 ℃變性后進行免疫印跡法檢測。

1.8 統計學分析

使用GraphPad Prism 軟件進行數據分析。各實驗均獨立重復3次，每次每組實驗小鼠為同窩出生，每組 2～6 只（對照組略少于實驗組），結果數據用±s表示。兩組間比較采用t檢驗。P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 小鼠肺組織細胞中SENP3 的定位

圖1 免疫熒光技術顯示小鼠肺組織中SENP3 的定位Figure 1 Localization of SENP3 in mouse lung by immunofluorescence

小鼠肺組織切片在微分干涉相差顯微鏡下觀察（圖1）顯示，肺泡Ⅰ型上皮細胞扁平，圍成肺泡壁；Ⅱ型上皮細胞分布于Ⅰ型上皮細胞之間，呈立方形，細胞核為圓形，突向肺泡腔內。肺泡Ⅱ型上皮細胞以特異性表達的SP-C 進行標記。免疫熒光檢測結果顯示，SENP3 主要定位于SP-C 陽性細胞，且以細胞質定位為主，提示SENP3主要表達于肺泡Ⅱ型上皮細胞的細胞質中。

2.2 饑餓后SENP3+/+和SENP3+/-小鼠肺組織細胞的自噬

圖2 免疫印跡法（A 和B）和免疫熒光技術（C 和D）檢測SENP3+/+小鼠和SENP3+/-小鼠肺組織中自噬相關蛋白LC3-Ⅰ和LC3-Ⅱ的量Figure 2 Autophagy level in SENP3+/+ and SENP3+/- mouse lung tissues by immunoblotting (A-B) and immunofluorescence(C-D)

小鼠肺組織的免疫印跡法檢測結果（圖2）顯示，SENP3+/-小鼠的SENP3 水平較SENP3+/+小鼠下降（39.98±2.32）%（P＜0.01），提示雜合子小鼠也具有一定的敲減效率；與對照組相比，饑餓小鼠肺組織的SENP3 水平有所升高（P＜0.01，圖2A）。在SENP3+/+小鼠中，未饑餓對照組肺組織中出現少量LC3-Ⅱ，提示肺組織細胞有基礎的自噬水平；饑餓后LC3-Ⅱ進一步增加，LC3-Ⅰ明顯減少，提示饑餓誘導后自噬增加（P＜0.01，圖2A）。關鍵的是，與SENP3+/+小鼠相比，SENP3+/-小鼠的LC3- Ⅱ水平更高（P＜0.01，圖2A），且LC3- Ⅱ/LC3-Ⅰ比例有所升高，差異具有統計學意義（P＜0.01，圖2B）。同時，與未加溶酶體抑制劑氯喹組相比，氯喹處理后LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比例都相應升高，且SENP3+/-小鼠中升高最為明顯，說明SENP3 的敲減加速了肺組織細胞自噬流。

因肺組織蛋白樣品中檢測出LC3-Ⅱ的量只能反映整體水平的自噬程度，故研究仍需分析發生自噬的細胞類型和程度。免疫熒光染色結果顯示，未饑餓時，SENP3 高表達的肺泡Ⅱ型上皮細胞質中無明顯的點狀LC3，而SENP3+/-小鼠中開始少量出現（圖2C 和2D）；饑餓48 h 后，SENP3+/+小鼠組的點狀LC3 有所增加（P＜0.05），而SENP3+/-小鼠組明顯增多（P＜0.01，圖2C 和2D）。另外，SENP3 低表達的肺泡Ⅰ型上皮細胞及其他細胞中無明顯的點狀LC3 形成，提示饑餓后自噬發生在肺泡Ⅱ型上皮細胞，且受到SENP3 的抑制。

2.3 饑餓后SENP3+/+小鼠和SENP3+/-小鼠肺組織中發生自噬的細胞類型

透射電子顯微鏡下觀察發現，SENP3+/+小鼠和SENP3+/-小鼠肺組織結構正常。肺泡Ⅱ型上皮細胞表面有短小的微絨毛，細胞質中可見特征性的嗜鋨性板層小體。饑餓組小鼠的Ⅱ型上皮細胞中出現明顯的自噬溶酶體結構，內含已經消化的內容物或碎片，而肺泡Ⅰ型上皮中未見相關結構（圖3），提示饑餓主要誘導了肺泡Ⅱ型上皮細胞的自噬。同時，SENP3+/-小鼠較SENP3+/+小鼠Ⅱ型上皮細胞中的自噬溶酶體數量更多（圖3）。

圖3 透射電子顯微鏡下觀察SENP3+/+小鼠和SENP3+/-小鼠肺泡Ⅱ型上皮細胞的自噬Figure 3 Autophage of alveolar type Ⅱ epithelial cells in SENP3+/+ and SENP3+/- mouse lung tissues under transmission electron microscopy

2.4 SENP3+/+小鼠和SENP3+/-小鼠肺組織中BECN1的SUMO化修飾

在肺組織樣品中檢測BECN1 的SUMO 化修飾，結果顯示BECN1 的量未受到饑餓和SENP3基因敲除的影響，但與SENP3+/+相比，SENP3+/-小鼠中可檢測到明顯的BECN1的SUMO2/3修飾條帶（圖4 上圖中泳道2 與泳道1 相比），提示在野生型小鼠中SENP3去除了BECN1的SUMO2/3修飾。但在SENP3+/-小鼠中，與未饑餓的對照組相比，饑餓后BECN1 的SUMO2/3 修飾是否增強，結果尚不明確，SUMO2/3抗體檢測時顯示為修飾減弱（圖4 上圖中泳道4 與泳道2 相比），BECN1 抗體檢測時顯示為修飾增強（圖4 中圖泳道4 與泳道2 相比）。

圖4 免疫共沉淀法檢測SENP3+/+和SENP3+/-小鼠肺組織中BECN1 的SUMO2/3 修飾Figure 4 SUMO2/3-modified BECN1 in SENP3+/+ and SENP3+/- mouse lung tissues by co-immunoprecipitation

3 討論

本研究初步在動物體內水平檢測了肺組織細胞的基礎自噬水平和饑餓誘導的自噬水平，發現饑餓時自噬主要發生于肺泡Ⅱ型上皮細胞。同時，研究也觀察到SENP3定位于肺泡Ⅱ型上皮細胞的細胞質，介導了重要的自噬相關蛋白BECN1的去SUMO 化修飾，并能夠抑制饑餓誘導的自噬，發揮自噬調控的作用。本研究結果一方面確認了SENP3可抑制肺組織細胞自噬，并初步探討了其作用機制，另一方面也對在動物水平檢測細胞自噬的方法進行了摸索，使得研究者對在體自噬調控提高了認識。

目前在體或器官水平檢測自噬流是自噬研究中較為困難的領域之一，應用LC3-Ⅱ的檢測并不理想。研究者通常采用LC3-GFP轉基因小鼠，器官類型則集中在骨骼肌、腦、心臟和視網膜，而肺較少[18-19]。本研究也確實發現免疫印跡技術檢測LC3-Ⅱ的量以及免疫熒光技術檢測LC3形成的點狀結構均不明顯，較培養細胞更難檢測。研究中預先給小鼠腹腔注射抑制劑氯喹，一定程度上改善了LC3-Ⅱ的檢測結果，提示該策略是研究在體自噬的可行方法。另外，本研究也綜合應用多種技術檢測自噬水平，可以在自噬的定量、細胞特異性及超微結構的水平上分別反映自噬的特征，也是在體水平全面檢測自噬的必要方法。

自噬水平的控制是自噬研究領域的一個重要問題，也是研究者理解自噬在疾病發生和治療中的角色的關鍵問題。在自噬的調控機制中，有研究發現SUMO化修飾這種蛋白質翻譯后修飾方式可能參與其中，并證明SUMO能增強神經細胞和心肌細胞的自噬水平[20-22]，但是去SUMO 化修飾的蛋白酶在自噬過程中發揮負調控作用的相關研究報道較少。本實驗室前期研究已發現，小鼠肝臟中BECN1的SUMO化修飾促進自噬，而SENP3通過對其去SUMO 化修飾抑制自噬的發生[14]。在小鼠睪丸組織中，饑餓應激后自噬發生于支持細胞（Sertoli 細胞），SENP3 基因敲除雜合子小鼠中自噬增加[23]。本研究在小鼠肺組織中繼續探索，發現饑餓后肺泡Ⅱ型上皮細胞出現自噬，而SENP3能抑制這種細胞的自噬，提示SENP3抑制自噬的角色在各種組織中具有一定的普遍性。

SE N P3 調控自噬的分子機制與蛋白質的SUMO2/3修飾有關。本研究中肺組織與其他研究中的肝組織類似，BECN1 的SUMO2/3 修飾能夠被SEN P3 去除。在機制研究上，人們已發現BECN1的SUMO2/3修飾易化了與紫外線抵抗相關基因（ultraviolet radiation resistance-associated gene，UVRAG）、磷脂酰肌醇-3-激酶催化亞單位3（phosphatidylinositol 3-kinase catalytic subunit type 3，PI3KC3，又稱為VPS34）、自噬相關蛋白14 樣蛋白（autophagy-related protein 14-like protein， ATG14L）的相互作用，增強了自噬起始核心復合物的活性。由于HEK293T細胞和肝細胞中均存在該機制，提示這個分子機制可能也存在于肺泡Ⅱ型上皮細胞。但因其他研究在體外發現這個復合物中的VPS34可以被SUMO1修飾[24]，故后續研究需要探索肺組織細胞中VPS34是否作為SENP3 的底物引起SUMO2/3 修飾的逆轉，以及是否參與自噬調控，以期進一步明確SENP3的作用機制。

雖然SENP3在體外培養細胞和機體中扮演重要角色，其基因敲除造成小鼠早期胚胎的死亡，但其在各種組織中的功能和定位均不明確。在體外培養的多種正常細胞和腫瘤細胞中，SENP3 定位于細胞核，且集中于核仁，尤其是基因過度表達時更為顯著[25]。研究發現在肝細胞的細胞質中存在SENP3 分布，并與BECN1 相互作用介導其去SUMO 化修飾[14]。本研究中免疫熒光檢測結果顯示SENP3 定位于肺泡Ⅱ型上皮細胞的細胞質，與其他研究結果不同，在細胞核中幾乎沒有發現SENP3，故未來仍需用多種技術綜合考察其定位，以全面了解其功能。

本研究探討肺組織細胞的自噬及其調控，具有一定的意義。自噬的程度影響應激時的細胞命運，即可能促進細胞存活抑或造成細胞死亡，而細胞命運的不同與刺激類型、程度和細胞類型有關。在肺部疾病中，自噬是否發生，與疾病的關系如何，這些研究報道不多，但研究結果已初步顯示了不同病原體誘導的自噬、發生自噬的細胞類型及對細胞的生物學意義。細菌、敗血癥及高氧誘導的急性肺損傷中，自噬發揮保護細胞和減少損傷的作用[15]。但也有研究報道了與此相反的現象，肺泡Ⅱ型上皮細胞的自噬導致炎性因子分泌量增加、細胞死亡和功能障礙，造成急性肺損傷加重[26-29]。H5N1 流感患者中，肺泡Ⅱ型上皮細胞的過度自噬也導致急性呼吸窘迫綜合征[30-31]，BECN1 基因敲除或3-甲基腺嘌呤抑制自噬后發病率降低，故抑制自噬可能成為治療H5N1感染的一個新策略[31-32]。本研究發現SENP3在肺組織中能夠發揮抑制細胞自噬的功能，故提高SENP3的量或增強其活性有望成為治療急性肺損傷的一個新策略。