巨細胞病毒對植入聚甲基丙烯酸甲酯小鼠部分免疫指標的抑制作用

江 蓉，張齊梅

(1. 四川省阿壩藏族羌族自治州人民醫院口腔科， 阿壩藏族羌族自治州 624000；2. 西南醫科大學附屬口腔醫院牙周黏膜科， 瀘州 646000)

科學技術的飛速發展，使得越來越多的醫用生物材料進入了口腔臨床和頜面部修復的領域。相對于傳統的金屬或者非金屬陶瓷材料，新型生物材料具有很強的抗沖擊性和抗摩擦性，在使用過程中磨損率也很低[1]。目前高分子材料是各種口腔科生物醫學材料的首要選擇[2]。聚甲基丙烯酸甲酯（polymethyl methacrylate, PMMA）具有透明性極好、強度高、耐光老化和質輕堅韌等優良特點。近期的研究發現PMMA 植入后，其細胞毒性和對機體免疫系統的影響均很小，因此被認為是牙修復材料很好的選擇[3-4]。巨細胞病毒（cytomegalovirus, CMV）是一種常見的機會性感染病毒，在人群中感染非常普遍，與口腔潰瘍和急性牙周炎等口腔疾病的發生緊密相關[5-7]。然而，CMV感染對口腔生物材料植入后免疫系統的作用，目前研究還很少。

1 材料與方法

1.1 實驗動物、試劑與儀器

SPF 級雄性BALB/c 小鼠45 只，4 周齡，體質量12～15 g ，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司[SCXK（京）2016-0011]；CMV 購自生工生物工程（上海）有限公司，將CMV 進行10 倍稀釋后定量接種細胞，按Reed-Muench法計算病毒致半數細胞感染量（50% tissue culture infective dose, TCID50）為105U/0.1 mL；PMMA購自上海眾榮新材料科技有限公司；小鼠淋巴細胞分離液購自天津TBD 公司；CD68、CD206、CCR7、CD3、CD4、CD8、CD25 和Foxp3 抗體均購自美國BD 公司；腫瘤壞死因子-α(TNFα)和白細胞介素-1β(IL-1β)的酶聯免疫吸附測定（ELISA）試劑盒均購自欣博盛生物科技有限公司；流式細胞儀購自美國BD 公司；酶標儀購自美國Biotek 儀器有限公司。

1.2 動物模型的構建[8]

本實驗在西南醫科大學口腔醫院實驗中心內開展[SYXK(川)2018-213]，設施達到ABSL-2 級實驗室相關生物安全要求。小鼠隨機分為空白對照組（n=30）和病毒感染組（n=15）。病毒感染組于腹腔內接種106U/mL 的病毒懸液10 μL，建立CMV 感染小鼠模型，空白對照組以相同方法注射相同體積的生理鹽水。模型建立7 d 后，在無菌操作下取小鼠尾靜脈血0.1 mL，采用酶聯免疫吸附試劑盒（南京建成生物研究所）檢測CMV IgM 和IgG。CMV IgM、IgG 均陽性者判斷為CMV 感染，即模型建立成功。建模7 d 后，模型組小鼠死亡2 只，造模不成功2 只，空白對照組30只小鼠和病毒感染組11只小鼠用于后續研究。

1.3 PMMA的植入

接種病毒后7 d，采用1%的戊巴比妥鈉麻醉小鼠，將0.5 cm×0.5 cm×0.1 cm 的PMMA植入到小鼠背部皮下。小鼠共分為3 組：空白對照組15 只小鼠進行假手術，作為對照組；空白對照組小鼠15 只皮下植入PMMA，作為植入對照組；病毒感染組小鼠11 只皮下植入PMMA，作為植入CMV 組。植入PMMA 后7 d，對照組和植入對照組小鼠分別死亡2只，植入CMV組小鼠死亡1 只。

1.4 單核/巨噬細胞、T 細胞亞群及調節性T 細胞（Treg 細胞）的檢測

小鼠植入PMMA 后7 d，采用1%的戊巴比妥鈉麻醉小鼠，打開胸腔，暴露心臟，用針頭刺入右心室，收集小鼠的心臟血，用淋巴細胞分離液分離出單個核細胞。采用流式細胞術分別進行單核/巨噬細胞、T 細胞亞群及Treg 細胞的檢測，三項檢測對應的流式抗體分別是C D 68、CD206 和CCR7 抗體，CD3、CD4 和CD8 抗體，以及CD4 和CD25 抗體，均室溫孵育20 min。采用流式細胞術分別檢測M1 型單核/ 巨噬細胞（CD68+CCR7+細胞）和M2 型單核/巨噬細胞（CD68+CD206+細胞）的比例，CD4+T 細胞（CD3+CD4+細胞）和CD8+T 細胞（CD3+CD8+細胞）的比例，以及Treg 細胞（CD4+CD25+Foxp3+細胞）的比例。

1.5 炎性因子的檢測

小鼠植入PMMA 后7 d，收集小鼠的心臟血，分離出血漿，ELISA 檢測TNF-α 和IL-1β 的表達，嚴格按照試劑盒說明書進行操作。

1.6 統計學分析

使用SPSS 17.0 軟件進行統計分析，實驗結果以±s表示。組間比較采用t檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 CMV抑制小鼠植入PMMA后的M1型單核/巨噬細胞比例升高

流式細胞術結果顯示，與對照組比較，植入對照組外周血中CD68+CCR7+M1 型單核/巨噬細胞的比例升高了44.63%（t＝2.794，P＝0.049），CD68+CD206+M2 型單核/巨噬細胞的比例降低了39.71%（t＝3.806，P＝0.019）；CMV 能夠顯著抑制PMMA引起的M1 型單核/巨噬細胞比例升高，與植入對照組比較，植入CMV組外周血中CD68+CCR7+M1 型單核/巨噬細胞的比例降低了73.18%（t＝5.896，P＝0.004），CD68+CD206+M2 型單核/巨噬細胞的比例則升高了2.18 倍（t＝7.971，P＝0.001）（圖1）。

2.2 CMV抑制小鼠植入PMMA后CD4+/CD8+T細胞比值

流式細胞術結果顯示，對照組與植入對照組外周血中CD4+/CD8+T 細胞比值沒有明顯差異（t＝1.564，P＝0.193）；CMV 能夠顯著抑制PMMA 植入后CD4+/CD8+T 細胞比值，相對于植入對照組，植入CMV 組外周血中CD4+/CD8+T細胞比值降低了42.91%（t＝6.468，P＝0.003）（圖2）。

圖1 CMV 抑制PMMA 引起的小鼠M1 型單核/巨噬細胞比例升高Figure 1 Cytomegalovirus (CMV) inhibits PMMA-induced increase of the proportion of M1 monocyte/macrophage ratio in mice

圖2 CMV 抑制PMMA 植入后小鼠CD4+/CD8+T 細胞比值Figure 2 Cytomegalovirus (CMV) inhibits the ratio of CD4+/CD8+T cells in mice after PMMA implantation

2.3 CMV促進PMMA植入后小鼠Treg細胞比例升高

流式細胞術結果顯示，對照組與植入對照組外周血中CD4+CD25+Foxp3+Treg 細胞比例沒有明顯差異（t＝0.464，P＝0.667）；CMV 能夠顯著促進Treg 細胞比例升高，相對于植入對照組，植入CMV 組外周血中CD4+CD25+Foxp3+Treg 細胞比例升高了2.49 倍（t＝4.495，P＝0.011）（圖3）。

2.4 CMV抑制PMMA引起小鼠炎性因子含量的升高

ELISA 結果顯示，相對于對照組，植入對照組外周血中TNF-α 和IL-1β 含量分別上升39.56%和46.78%（t＝2.897，P＝0.044 和t＝4.023，P＝0.016）；CMV 能夠抑制PMMA 引起的炎性因子含量升高，相對于植入對照組，植入CMV組外周血中TNF-α 和IL-1β 的含量分別降低了71.65%和57.95%（t＝7.236，P＝0.019 和t＝7.543，P＝0.002）（圖4）。

圖3 CMV 促進PMMA 植入后小鼠Treg 細胞比例升高Figure 3 Cytomegalovirus (CMV) promotes an increase of the proportion of Treg cells in mice after PMMA implantation

圖4 CMV 抑制PMMA 引起的炎性因子含量升高Figure 4 Cytomegalovirus (CMV) inhibits PMMA-induced increase of the concentration of inflammatory factors in mice

3 討論

目前，有大量的生物材料被應用于口腔醫學領域，這些材料在應用于臨床前需要經過各項生物性能檢測，很多都具有良好的生物相容性和物理特性[9]。據統計，超過50%的人群感染CMV，在免疫力低下的情況下，CMV可引起多種口腔疾病，因此接受口腔植入物的患者至少有一半存在CMV 感染[10]。PMMA 是目前使用最多的高分子材料之一。本研究發現在正常生理情況下PMMA不會引起顯著的炎性反應，適度的炎性反應有利于組織的修復及清除植入局部的病原微生物；然而在CMV感染的情況下，PMMA植入后CMV會顯著抑制局部的免疫反應，這可能不利于損傷組織的修復。

單核/ 巨噬細胞是機體固有免疫的重要細胞，按照其表型可以分為M1 型和M2 型。M1 型單核/巨噬細胞是主要的炎性細胞，能夠分泌炎性因子或者直接吞噬并清除植入物局部的壞死組織，此外還能啟動組織局部的修復和血管生成。M2 型單核/巨噬細胞是抑制性細胞，能夠分泌免疫抑制因子，抑制局部的炎性反應。研究發現PPMA 植入后，會輕微引起M1 型單核/巨噬細胞升高，降低M2 型單核/巨噬細胞，這有利于局部壞死組織的清除并抑制病原微生物的增殖[11-13]。然而CMV的感染會大大降低M1型單核/巨噬細胞比例，促進M2 型單核/巨噬細胞比例的升高，使得植入物局部成為一個免疫抑制的微環境，不利于壞死組織的清除，還可能引起局部感染的加重。

T細胞是機體細胞免疫的主要細胞，CMV感染會引起CD4+/CD8+T 細胞比值下降，Treg 細胞比例升高，使整個機體處于免疫抑制的狀態。Treg 細胞是機體的主要免疫抑制細胞，能夠通過分泌IL-10 和轉化生長因子-β，促進病原微生物的逃逸，可能會引起或者加重機體的感染[14-16]。本研究發現，PPMA 植入后，CD4+/CD8+T 細胞比值以及Treg 細胞比例均沒有顯著變化。CMV感染會顯著降低PPMA植入后CD4+/CD8+T細胞比值，而Treg 細胞比例則會顯著升高，這使得材料植入局部免疫力十分低下，不利于壞死組織和病原微生物的清除。

本研究結果提示，CMV能夠顯著抑制PPMA植入后的免疫反應，可為CMV 感染患者口腔生物材料植入后的抗病毒治療提供參考依據。