滲透壓脅迫對耐鹽乳酸菌發酵特性的影響

畢夢迪，歐陽銘珊，黎 旭，張秀瓊，尹萍萍，蔡林蘅，武 攀，李寶坤

（石河子大學 食品學院，新疆 石河子832000）

乳酸菌是一類能夠發酵碳水化合物并且產生乳酸的無芽孢、革蘭氏陽性細菌[1]。近年來，大量的研究都證實了乳酸菌具有益生特性，特別是在改善人體腸道微環境方面發揮重要作用[2-3]。食品加工過程中，特別是諸如傳統發酵香腸、發酵酸魚、火腿、醬油、奶酪、泡菜等發酵食品的制備過程中往往會加入大量的食用鹽，賦予產品風味和抑制雜菌的同時延長食品的保質期[4-6]，但高濃度的鹽在一定程度上會抑制發酵過程中乳酸菌的生長，鹽脅迫會損傷細胞膜結構，進而導致胞內各種代謝紊亂甚至細胞死亡[7-8]，但是最近的研究顯示，鹽脅迫具有提高鼠李糖乳桿菌（Lactobacillus rhamnosus）的富硒能力的作用[9]。

新疆擁有牧草地面積約0.511億km2，是我國重要的畜牧業大省[10]，其中伊犁牧區是新疆最主要的畜牧業基地之一。新疆少數民族有收集動物乳制作發酵奶制品的傳統，從牧區奶制品和環境中挖掘菌種資源并加以保護成為一項重要工作[11-12]，蔣艾廷等[13]從新疆塔城傳統酸奶中篩選出具有優良產酸性能的30株乳酸菌，并對其自溶度和蛋白酶活力進行了研究；金丹等[14]從新疆塔城地區酸馬奶中分離了53株乳酸菌，并篩選出5株能耐受13%乙醇的乳酸菌；張亞川等[15]從新疆伊犁州乳品中初步分離純化出71株乳酸菌，并從中篩選出3株符合酸乳發酵菌種要求的德氏乳桿菌（Lactobacillus delbrueckii）。目前研究主要集中于乳酸菌的生理特性、生理學功能及其在工業中的應用，對高滲情況下乳酸菌發酵性能的研究較少，而乳酸菌發酵劑的生產性能（包括產香性、產粘性、產酸性）和抗逆性（耐酸耐膽鹽能力）直接關系到最終發酵制品的性能，同時也是影響產品質量的一個因素。

本研究利用傳統分離技術從新疆牧區土壤中篩選耐鹽乳酸菌，通過形態觀察及分子生物學技術對其進行鑒定，并對其發酵特性，特別是在高滲環境下（7%、8%NaCl）的發酵性能（耐酸耐膽鹽能力）進行研究，以期獲得發酵性能好和抗逆性強的優良發酵乳酸菌菌株，為高鹽發酵食品的商業發酵劑開發提供研究基礎，確保發酵乳等制品有一定的活菌數，食用后能在腸道中定植。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 樣品

土樣來源于新疆維吾爾自治區伊犁哈薩克自治州額敏縣牧區，具體信息見表1。

表1 土樣來源Table 1 Source of soil samples

1.1.2 試劑

無水乙醇（純度≥99.7%）：天津市富宇精細化工有限公司；細菌基因組總脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）提取試劑盒：北京天根生化科技有限公司；豬膽鹽（純度≥90%）：上海麥克林生化科技有限公司；革蘭氏染液：北京索萊寶生物科技有限公司。

1.1.3 培養基

MRS液（固）體培養基：青島高科技工業園海博生物技術有限公司。含碳酸鈣的MRS（CaCO3-MRS）固體培養基：MRS固體培養基中添加1.5%的碳酸鈣。

1.2 儀器與設備

TC-512聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）擴增儀：英國Techne公司；T100 Power Pac Universal電泳儀、Universal Hood ⅡGel DOC XR凝膠成像系統：美國BioRad公司；CX21FS1光學顯微鏡：日本Olympus公司；LAC-5040S標準型pH計：上海精密科學儀器有限公司；Bnp-9272智能生化培養箱：上海精宏試驗設備有限公司；5424R高速冷凍離心機：德國Eppendorf公司；Synergy 2多功能酶標儀：美國BIOTEK儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 乳酸菌的分離

稱取1.0 g土壤樣品，加入10 mL無菌生理鹽水，混勻，靜置10 min后取上清液1 mL加至20 mL含有7% NaCl的MRS液體培養基中，37 ℃靜置培養48 h。取菌液在CaCO3-MRS平板上劃線，37 ℃培養48 h[16]。挑取溶鈣圈較大、革蘭氏染色為陽性、接觸酶試驗為陰性并具有乳酸菌典型形態學特征的菌落，在MRS固體培養基上再次劃線分離純化后斜面保存備用[17]。

1.3.2 篩選耐鹽乳酸菌的篩選

將分離純化得到的乳酸菌菌株進行活化并培養16～18 h后，以2%（V/V）的接種量分別接種至NaCl含量為7%、8%、9%、10%的MRS肉湯培養基中，37 ℃培養24 h，通過培養基渾濁情況的變化篩選出耐鹽乳酸菌[18]。

1.3.3 耐鹽乳酸菌的分子生物學鑒定

根據DNA提取試劑盒說明書步驟提取目標耐鹽乳酸菌菌株的DNA，以其為模板，采用引物27F（5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'）和1492R（5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3'）對篩選菌株的16S rDNA序列進行PCR擴增。PCR擴增體系：10×Buffer 2.5 μL，10 mmol/L脫氧核糖核苷三磷酸（deoxy-ribonucleoside triphosphate，dNTP）0.5 μL，10 μmol/L引物各0.5 μL，Taq酶1.25 U，模板2 μL，雙蒸水（ddH2O）定容至25 μL。PCR擴增程序：95 ℃預變性10 min；95 ℃變性30 s，54 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，34個循環；72 ℃再延伸10 min。采用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR擴增產物特異性。將電泳檢測合格的PCR擴增產物送至上海生工生物有限公司進行測序。將測序基因序列提交至美國國立生物技術信息中心（national center for biotechnology information，NCBI）的GenBank數據庫進行基本局部比對搜索工具（basic local alignment search tool，BLAST）比對分析，選取同源性較高的模式菌株的16S rDNA序列，采用軟件Mega5.0構建系統發育樹。

1.3.4 篩選菌株在高滲環境下的生長曲線和產酸能力

按2%的接種量將活化培養至對數生長末期的菌株分別接種于含7%、8%NaCl的MRS肉湯培養基中，37 ℃恒溫培養48 h，每隔2 h取樣在波長600 nm條件下測定樣品的OD600nm值和pH值，繪制乳酸菌的生長曲線和產酸曲線。

1.3.5 篩選菌株在高滲環境下的耐酸、耐膽鹽脅迫能力

耐酸性能的測定：將活化好的篩選菌株按2%的接種量分別接種到含7%、8%NaCl，pH值為3.0、4.6的MRS液體培養基中，37 ℃條件下培養48 h，每隔2 h取樣在波長600 nm條件下測定樣品的OD600nm值，繪制乳酸菌的生長曲線，并且每隔2 h取樣，測定pH值，繪制產酸變化曲線。

耐膽鹽性能的測定：將活化好的篩選菌株按2%的接種量分別接到含7%、8% NaCl，0.10%、0.15%膽鹽的MRS液體培養基中，37 ℃條件下培養48 h，每隔2 h取樣在波長600 nm條件下測定樣品的OD600nm值，繪制乳酸菌的生長曲線，并且每隔2 h取樣，測定pH值，繪制產酸變化曲線。

1.3.6 篩選菌株耐鹽性能的測定

將培養至對數末期的菌液，按2%的接種量分別接種于含10%和12%NaCl的MRS液體培養基中，37 ℃條件下脅迫3 h后進行涂布于MRS固體培養基，37 ℃培養48 h后進行菌落計數（N），同時對接種液進行菌落計數（N0），計算存活率，其計算公式如下：

2 結果與分析

2.1 耐鹽乳酸菌菌株的分離與篩選

從27個土壤樣品中共分離純化得到64株疑似乳酸菌，通過篩選共獲得4株耐鹽乳酸菌，編號分別為a、b、c、d。4株乳酸菌均能在含8%NaCl的MRS液體培養基中生長，其中菌株c能夠在含9%NaCl的MRS液體培養基中生長，在含10%NaCl的MRS液體培養基中4株菌的生長被明顯抑制。

2.2 耐鹽乳酸菌菌株的鑒定

2.2.1 形態觀察

對篩選出的4株耐鹽乳酸菌菌株進行形態學觀察，結果見圖1。

圖1 耐鹽乳酸菌的菌落形態及細胞形態Fig. 1 Colony and cell morphology of salt tolerant lactic acid bacteria

由圖1可知，在MRS固體培養基上，4株耐鹽乳酸菌的菌落均呈乳白色，并且中央隆起具有濕潤表面，邊緣整齊，呈乳白色，革蘭氏染色結果均為陽性，個體微小，周身無鞭毛與芽孢，符合乳酸菌基本特征。

2.2.2 分子生物學鑒定

4株耐鹽乳酸菌菌株的系統發育樹見圖2。

圖2 基于16S rDNA基因序列耐鹽乳酸菌菌株的系統發育樹Fig. 2 Phylogenetic tree of salt tolerant lactic acid bacteria based on 16S rDNA gene sequences

由圖2可知，菌株a、b、c與海氏腸球菌（Enterococcus hirae）聚于一支，親緣關系最近；菌株d與植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）聚于一支，親緣關系最近，因此鑒定菌株a、b、c均為為海氏腸球菌（Enterococcus hirae），菌株d為植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）。

2.3 耐鹽乳酸菌的發酵特性

2.3.1 耐鹽乳酸菌的生長特性

鄔慧穎[19]研究鹽脅迫響應基因對菌體分裂增殖的影響結果發現，鹽脅迫響應基因膜轉運體基因feoA的缺失會使遲滯期被延長并影響菌體的分裂增殖。由圖3可知，L.plantarumdd在7%NaCl含量下的最終OD600nm值為1.866，而在8% NaCl含量下的最終OD600nm值為0.760，E. hiraea、b、c在7%NaCl含量下的最終OD600nm值分別為0.898、0.773、0.873，而在8%NaCl含量下的最終OD600nm值分別為0.105、0.086、0.117，結果表明，隨著NaCl含量的增加，各菌株的生長受到了不同程度的抑制，其中L.plantarumdd的生長特性相對于其他三株更好，E.hiraea、b、c差別不大。

圖3 在NaCl含量7%（a）及8%（b）條件下耐鹽乳酸菌的生長曲線Fig. 3 Growth curves of salt tolerant lactic acid bacteria under 7% (a)and 8% (b) NaCl concentration conditions

2.3.2 耐鹽乳酸菌的產酸特性

由圖4可知，隨著NaCl含量的升高，各菌株的產酸速率明顯降低。L.plantarumd在7%NaCl含量下的最終pH值為3.48，在8%NaCl含量下的最終pH值為3.79，E.hiraea、b、c在7%NaCl含量下的最終pH值分別為4.01、4.08、3.97，而在8%NaCl含量下的最終pH值分別為4.99、5.09、4.63，結果表明，隨著NaCl含量的增加，各菌株的產酸受到了不同程度的抑制。其中L.plantarumdd的產酸特性相對于其他三株更好，E.hiraea、b、c差別不大。

圖4 耐鹽乳酸菌在NaCl含量7%（a）及8%（b）條件下的產酸曲線Fig. 4 Acid production curves of salt tolerant lactic acid bacteria under 7% (a) and 8% (b) NaCl concentration conditions

2.3.3 耐鹽乳酸菌的耐酸性能研究

圖5 pH3.0時耐鹽乳酸菌在NaCl含量7%（a）及8%（b）條件下的生長曲線Fig. 5 Growth curves of salt tolerant lactic acid bacteria under 7% (a)and 8% (b) NaCl concentration conditions at pH 3.0

圖6 pH4.6時耐鹽乳酸菌在NaCl含量7%（a）及8%（b）條件下的生長曲線Fig. 6 Growth curves of salt tolerant lactic acid bacteria under 7% (a)and 8% (b) NaCl concentration conditions at pH 4.6

圖7 pH3.0時耐鹽乳酸菌在NaCl含量7%（a）及8%（b）條件下的產酸曲線Fig. 7 Acid production curves of salt tolerant lactic acid bacteria under 7% (a) and 8% (b) NaCl concentration conditions at pH 3.0

由圖5可知，在7%和8%NaCl含量下，E.hiraea、b、c和L.plantarumd在pH 3.0的酸性環境，均未出現明顯的生長。結果表明，在pH 3.0的酸性環境，7%和8% NaCl含量下，E.hiraea、b、c和L.plantarumd 生長均受到明顯抑制。

由圖6可知，在7%和8%NaCl含量下，L.plantarumd比E.hiraea、b、c更適應pH 4.6的酸性環境，出現明顯的生長，同時8%NaCl含量使E.hiraea、b、c和L.plantarumd的生長受到抑制。

由圖7可知，在7%和8%NaCl含量下，pH 3.0的酸性環境中E.hiraea、b、c和L.plantarumd幾乎不產酸，生長受到明顯抑制。

圖8 pH4.6時耐鹽乳酸菌在NaCl含量7%（a）及8%（b）條件下的產酸曲線Fig. 8 Acid production curves of salt tolerant lactic acid bacteria under 7% (a) and 8% (b) NaCl concentration conditions at pH 4.6

由圖8可知，產酸情況的變化也應證了OD600nm值的變化結果，在7%和8%NaCl含量下，pH 4.6的酸性環境中E.hiraea、b均在24 h開始產酸，但pH下降幅度不大。E.hiraec幾乎不產酸，生長受到明顯抑制。L.plantarumd在培養2 h后pH值開始迅速降低，36 h后逐漸停止產酸，最終pH值分別下降至3.42和3.56。

結果表明，在7%、8%NaCl脅迫下，L.plantarumd的酸耐受性較好。

2.3.4 耐鹽乳酸菌的耐膽鹽性能研究

乳酸菌需能夠耐受胃液中的強酸與腸道內的高濃度膽鹽，并在人體內大量存活才能發揮其益生作用[20]。由圖9可知，在0.10%膽鹽脅迫下，在7%和8%NaCl含量條件下，E.hiraea、b、c具有較好的膽鹽脅迫抗性，且均在培養24 h達到對數生長末期，而L.plantarumd未有明顯生長趨勢。海氏腸球菌中E.hiraec抗性最好，E.hiraeb最差，0.10%的膽鹽對L.plantarumd的抑制作用明顯。

圖9 0.10%膽鹽時耐鹽乳酸菌在NaCl含量7%（a）及8%（b）條件下的生長曲線Fig. 9 Growth curves of salt tolerant lactic acid bacteria under 7% (a)and 8% (b) NaCl concentration conditions at 0.10% bile salt

圖10 0.15%膽鹽時耐鹽乳酸菌在NaCl含量7%（a）及8%（b）條件下的生長曲線Fig. 10 Growth curves of salt tolerant lactic acid bacteria under 7% (a)and 8% (b) NaCl concentration conditions at 0.15% bile salt

由圖10可知，4株菌在0.15%膽鹽中的生長趨勢與在0.10%膽鹽中類似，海氏腸球菌均能生長而植物乳桿菌L.plantarumd未有明顯生長趨勢，但值得指出的是，E.hiraec在7%NaCl含量下的生長速度和對膽鹽的抗性要明顯優于E.hiraea和E.hiraeb，而在8%NaCl含量下E.hiraec沒有表現出類似的優勢，這說明在面對膽鹽脅迫時，NaCl含量的改變可能會影響到菌株的脅迫抗性。

圖11 0.10%膽鹽時耐鹽乳酸菌在NaCl含量7%（a）及8%（b）條件下的產酸曲線Fig. 11 Acid production curves of salt-tolerant lactic acid bacteria under 7% (a) and 8% (b) NaCl concentration conditions at 0.10% bile salt

由圖11可知，在0.10%膽鹽的環境中，E.hiraea、b在7%NaCl含量下培養2 h后產生大量有機酸，pH值迅速下降，12 h左右pH值趨于穩定；在8%NaCl含量下，培養10 h左右pH值迅速下降，12～24 h期間，pH值的下降速率明顯減小。E.hiraec在7%NaCl含量下，培養6 h左右pH值迅速下降，24 h時產酸停止；在8%NaCl含量下，培養8 h左右pH值迅速下降，24 h左右產酸停止。L.plantarumd在7%和8%NaCl含量下產酸性能均優于海氏腸球菌，但是在8%NaCl含量時，產酸在培養24 h后即停止。

由圖12可知，在0.15%膽鹽的環境中，7%NaCl含量下，E.hiraea、b在8 h左右pH值開始下降，24 h產酸停止；在8%NaCl含量下，E.hiraea、b、c的產酸曲線幾乎相同，12 h開始產酸，pH值迅速下降，24h左右pH值下降減緩。L.plantarumd在7%NaCl含量下，8 h左右pH值迅速下降，與其他3株菌不同的是12 h左右產酸停止，而在8%NaCl含量下，其延滯時間比海氏腸球菌更短。

圖12 0.15%膽鹽時耐鹽乳酸菌在NaCl含量7%（a）及8%（b）條件下的產酸曲線Fig. 12 Acid production curves of salt-tolerant lactic acid bacteria under 7% (a) and 8% (b) NaCl concentration conditions at 0.15% bile salt

結果表明，在7%、8%NaCl脅迫下，E.hiraea、b、c膽鹽耐受性較好。

2.4 耐鹽乳酸菌的耐鹽性能研究

對篩選出的耐鹽乳酸菌分別用10%與12%的NaCl脅迫3 h，進一步考察其對NaCl的耐受性，結果見圖13。由圖13可知，4種耐鹽乳酸菌對鹽的耐受性差異顯著（P＜0.05）。在10%的NaCl含量下，E.hiraea、b、c、L.plantarumd的存活率分別為45.89%、60.69%、47.34%、41.58%；在12%的NaCl含量下，E.hiraea、b、c、L.plantarumd的存活率分別為43.72%、56.13%、39.24%、35.70%。由此可知，E.hiraeb對鹽的耐受性最好，E.hiraec和E.hiraea次之，L.plantarumd對鹽的耐受性最差。

圖13 耐鹽乳酸菌對鹽的耐受性Fig. 13 Tolerance of salt tolerant lactic acid bacteria to salt

3 結論

從新疆維吾爾自治區伊犁哈薩克自治州額敏縣的土壤樣品中分離出64株乳酸菌，從中篩選出4株耐鹽乳酸菌（a、b、c及d），通過形態觀察及分子生物學技術鑒定菌株a、b及c均為海氏腸球菌（Enterococcus hirae），菌株d為植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）。在高鹽脅迫（7%、8%NaCl）下，L.plantarumd的生長特性、產酸及耐酸性能最好，但耐膽鹽能力最差，E.hiraea、b、c的耐膽鹽脅迫能力更佳；在10%和12%的NaCl含量下脅迫3 h，4株菌的存活率均能維持在36%以上，其中E.hiraeb的耐鹽能力最佳，存活率最高。