瀏陽豆豉發酵中高產酶活菌株的分離鑒定及酶活性分析

陳 怡，劉 洋，蔣立文*，李 跑，偉 明，覃業優

（1.湖南農業大學 食品科學技術學院，湖南 長沙410128；2.食品科學與生物技術湖南省重點實驗室，湖南 長沙410128；3.溢品鮮調味食品廠，湖南 瀏陽410000；4.湖南壇壇香食品科技有限公司，湖南 長沙410000）

瀏陽豆豉以黑豆為原料，經過浸泡、蒸煮、自然接種、洗曲、堆積發酵、曬干后成為藥食同源產品。瀏陽豆豉是曲霉型發酵豆豉，制曲期間主要微生物屬以曲霉、根霉為主，而后發酵期則有大量酵母菌參與[1]。豆豉不僅具有良好的風味，還具有抗氧化、溶血栓、降血糖等營養價值[2-5]，大豆在發酵過程中會產生新的活性物質，如活性肽、不飽和脂肪酸、大豆異黃酮等[6-7]，這些活性物質以及良好風味的形成均與微生物產酶密切相關。豆豉發酵過程中，在微生物產蛋白酶的作用下將大分子蛋白水解成小分子多肽和氨基酸以及各種香氣成分前提物質，因此微生物產蛋白酶活性與豆豉中蛋白質的水解程度密切相關。同時，微生物產生的纖維素酶通過分解纖維素使蛋白質裸露出來，從而提高大豆蛋白的消化率[8-9]，加速了蛋白質的降解及各類氣味物質的生成以賦予豆豉獨特的風味。此外脂肪酶也是豆豉發酵過程中重要的水解酶，可催化大豆中的油脂，生成甘油、脂肪酸和甘油單酯或者二酯，有助于豆豉獨特風味的形成[10]。

為了獲得高產酶活菌株，學者們在微生物菌種分離方面做了大量的研究，如任璐等[11]從永川豆豉和三臺豆豉中分離到2株毛霉YC-1和ST-1，其產蛋白酶活分別為176.891 U/mL和51.201 U/mL，產纖維素總體酶活分別為107.645 U/mL和66.762 U/mL。郭聰等[12]通過從熱帶海水養殖系統中篩選得2株地衣芽孢桿菌LD-1205和DF-1307，其以橄欖油為唯一碳源培養60 h后，纖維素酶活力分別達到56.3 U/mL、60.7 U/mL。鄧維琴等[13]從發酵成曲的郫縣豆瓣醬篩選得到2株具有高產蛋白酶能力的菌株PCSM001和PCSM002，其在麩皮中培養3 d蛋白酶酶活分別為1 450.25 U/g、1 703.25 U/g。CHANCHAROONPONG C等[14]以60%大豆含量的曲司為底物對米曲霉（Aspergillus oryzae）S產酶進行了研究，結果表明在48 h時蛋白酶活性達到最高為84.38 U/g（干質量）。徐偉芳等[15]從含油脂的土壤中得到一株甲基營養型芽孢桿菌（Bacillus methylotrophicus）SLB-1，該菌在30 ℃、pH 7.0條件下的脂肪酶酶活為21.22 U/mL。YIN H C等[16]研究發現，枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）在以豆粕作為固態發酵可產生羧肽酶。

為了篩選瀏陽豆豉的關鍵微生物，并評估其在瀏陽豆豉發酵過程中的作用，本研究從瀏陽豆豉中分離高產酶活菌株，對其進行形態學觀察及分子生物學鑒定，并對其蛋白酶、纖維素酶和脂肪酶的酶活力進行測定，旨在獲得新的發酵菌株，為后續豆豉的工業化生產提供理論指導與實踐基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 試驗材料

麩皮：湖南農業大學東之源超市；豆豉曲醅：瀏陽某豆豉廠。

1.1.2 化學試劑

3,5-二硝基水楊酸（3,5-dinitrosalicylic acid，DNS）、福林試劑、碳酸鈉、三氯乙酸、磷酸鹽、酪蛋白、酪氨酸、鹽酸（均為分析純）：國藥集團化學試劑有限公司；真菌基因組脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）提取試劑盒Solarbio D2300：北京索萊寶科技有限公司。

1.1.3 培養基

孟加拉紅瓊脂培養基、馬鈴薯葡萄糖瓊脂（potatodextrose agar，PDA）培養基、查氏瓊脂（Czapek agar，CA）培養基、麥芽汁瓊脂培養基、酵母浸出粉胨葡萄糖瓊脂培養基：北京陸橋生物技術有限公司。

1.2 儀器與設備

CX41RF光學顯微鏡：日本Olumpus公司；Thermo Scientific Multiskan FC全波長酶標儀：賽默飛世爾科技（中國）有限公司；LDZX-50KBS立式高壓滅菌鍋：上海申安醫療器械有限公司；SW-CJ系列凈化工作臺：上海新苗醫療器械制造有限公司；DHP120恒溫培養箱：上海實驗儀器廠有限公司、TP-620A電子天平：湘儀天平儀器設備有限公司；HHS-11-6數顯6孔電熱恒溫水浴鍋：常州杰博森儀器有限公司、HY45恒溫搖床：深圳匯成科技有限公司；Verity 96well聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）儀：美國ABI公司；DYY-6C電泳儀：北京六一儀器廠；FR-980A凝膠成像儀：上海復日科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 瀏陽豆豉加工工藝流程

1.3.2 優勢霉菌的篩選及分離純化

采集制曲階段第3、5、7、9、14天的豆豉各25 g分別定容于225 mL生理鹽水中，搖床振蕩30 min，采用稀釋涂布平板法做4個稀釋梯度即10-2、10-3、10-4、10-5，各取菌懸液200 μL分別涂布至孟加拉紅培養基、麥芽汁瓊脂培養基、查氏培養基、酵母浸出粉胨葡萄糖培養基、PDA培養基上，在28 ℃條件下靜置培養，每隔24 h觀察1次，3～5 d后根據菌落形態和孢子顏色分離平板上生長的所有菌種，在篩選出優勢霉菌的同時優化培養基，在平板上重復點接3次以上，直至得到單個菌落。

1.3.3 菌液的制備

將純化好的霉菌接入麩皮中擴大培養，28 ℃培養72 h，取5 g研細，加pH為7.2的磷酸緩沖溶液至100 mL，在40 ℃水浴下間斷的攪拌1 h，過濾得到菌液。

1.3.4 分離菌株的鑒定

（1）形態觀察

菌落特征觀察：將霉菌接入PDA培養基中觀察其菌落特征，包括形狀、大小、表面結構、松緊度、孢子顏色以及是否產生色素等。

菌絲形態觀察：于潔凈載波片上，滴一滴乳酸石炭酸棉藍染色液，可用接種環挑取菌落邊緣的少量孢子放入棉藍染色液中，蓋上波片觀察菌株細胞形態。

（2）菌株分子生物學鑒定

DNA提取：對霉菌進行ITS rDNA鑒定，上游引物：5'-TCCG TAGG TGAA CCTG CGG-3'；下游引物：5'-TCCT CCGC TTAT TGAT ATGC-3'。

PCR擴增體系：PCRMix緩沖溶液5μL，兩端引物濃度均為10 μmol/L，模版DNA 1 μL，再加入20 μL雙蒸水（ddH2O）。PCR擴增條件為98 ℃預變性2 min；98 ℃變性1 s，54 ℃退火10 s，72 ℃延伸10 s，35個循環；72 ℃延伸5 min。PCR擴增產物經1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測后，送杭州聯川生物有限公司測序部測序。

（3）系統發育樹的構建

利用美國國家生物技術信息中心（national center of biotechnology information，NCBI）中基本局部比對搜索工具（basic local alignment search tool，BLAST）對DNA序列進行對比分析，構建系統發育樹。自GenBank下載的菌株如下：Aspergillussp.（MH836320.1）、Aspergillustamarii（MN339986.1）、Aspergillus toxicarius（MH865314.1）、Aspergillus nomius（MG575481.1）、Aspergillus flavofurcatus（MK120607.1）等。用Mega軟件以Maximum Likehood法繪制系統發育樹，以Bootstrap對系統發育樹進行檢驗1 000次重復。

1.3.3 蛋白酶活性

蛋白酶活性的測定采用分光光度法[17]。酪氨酸標準曲線的繪制：配制質量濃度分別為0、20 μg/mL、40 μg/mL、60 μg/mL、80 μg/mL、100 μg/mL系列酪氨酸溶液。分別取1 mL系列酪氨酸溶液至10 mL試管中，依次加入0.4 mol NaCO35 mL、1∶2稀釋好的福林試劑1 mL，40 ℃水浴中保溫顯色20 min，以空白管調零點，于波長660 nm條件下測定吸光度值（OD660nm值）。以酪氨酸質量濃度（x）為橫坐標，吸光度值（y）為縱坐標，繪制酪氨酸標準曲線。按照酪氨酸標準曲線回歸方程計算樣品中蛋白酶的活性，其計算公式如下：

式中：A為3次平行試驗平均吸光度值；W為樣品水分百分含量，%；N為稀釋倍數；4為反應試劑總體積，mL；10為反應時間，min。

蛋白酶酶活定義：1 g固體酶粉（或1 mL液體酶），在40 ℃（酸性pH=3.0；中性pH=7.5；堿性pH=10.5）條件下，每分鐘水解酪素產生1 μg酪氨酸為一個酶活單位（U/mL）。

1.3.4 纖維素酶活性

纖維素酶活性測定采用DNS法[18]。

葡萄糖標準曲線繪制：取5支試管分別加0.2 mL、0.4 mL、0.6 mL、0.8 mL、1.0 mL的0.1 mg/mL葡萄糖標準溶液于試管中，用蒸餾水分別補充至2.0 mL，加1.5 mL DNS，以空白試劑調零，在波長540 nm處測定吸光度值。以葡萄糖質量濃度（x）為橫坐標，吸光度值（y）為縱坐標，繪制葡萄糖標準曲線。按照葡萄糖標準曲線回歸方程計算樣品中纖維素酶的活性。

纖維素酶酶活定義：在30 ℃、pH值為5.5條件下，每分鐘從質量濃度為4 mg/mL的羧甲基纖維素溶液中降解釋放1 μmol還原糖需要的酶量為一個酶活單位（U/mL）。

1.3.5 脂肪酶活性

油酸標準曲線的繪制：配制一系列不同濃度的油酸溶液，分別取1 200 μL于1.5 mL離心管中，加入300 μL顯色劑（5%的醋酸酮溶液用吡啶調至pH=6.1），搖勻后離心，取上層有機相，在波長710nm處測定吸光度值。首先將0.0667mol/L磷酸鹽緩沖溶液和橄欖油放入水浴恒溫磁力攪拌器37 ℃中預熱30 min。測試管中加入125 μL酶溶液，750 μL磷酸鹽緩沖溶液和250 μL的橄欖油，37 ℃條件下反應10 min后立即加入2 000 μL甲苯，標準管中由375 μL的蒸餾水代替橄欖油與酶溶液。37 ℃振蕩反應10 min后，8 000×g、25 ℃條件下離心10 min，取上層清液，空白管與測定管分別加入1 200 μL對應上清液和300 μL顯色劑。用分光光度計在波長710 nm處測其吸光度值。

脂肪酶酶活性定義：37 ℃條件下，每克組織每分鐘水解橄欖油生成1 μmol 脂肪酸為一個酶活單位（U/mL）。

2 結果與分析

2.1 菌株的分離純化與鑒定

2.1.1 分離菌株形態觀察

取瀏陽豆豉發酵過程中制曲階段的第3、5、7、9、14天的豆豉，采用稀釋涂布平板法，分別涂布至孟加拉紅培養基、麥芽汁瓊脂培養基、查氏培養基、酵母浸出粉胨葡萄糖培養基、PDA培養基上，對分離菌株進行形態學觀察，結果見圖1。由圖1可知，分離得到3株菌，分別編號為621、000、5132。

圖1 菌株621、000、5132的菌落（A、B、C）及細胞（a、b、c）形態Fig. 1 Colony (A、B、C) and cell (a、b、c) morphology of strain 621, 000 and 5132

由圖1A可知，菌株621在麥芽汁瓊脂培養基上于28 ℃培養3 d后，菌落質地蓬松呈絮狀且菌絲體發達，菌落較厚且邊緣呈白色，成熟后中間的孢子呈黃色，不透光呈不規則的邊緣，菌落直徑為1.5～2.0 cm。由圖1a可知，621經棉蘭染色后的分生孢子梗且具有頂端膨大呈球狀的頂囊，以及淺黃色的孢子，根據《真菌鑒定手冊》及其他文獻，可鑒定該菌為半知菌叢梗孢科曲霉屬。由圖1B可知，菌株000在CA培養基上經28 ℃培養3 d后，菌落直徑為4.0～4.5 cm且后期可長滿整個平板，14～36 h時呈不透光的灰白色棉絮狀，邊緣不規則，表面有一些細小的菌絲但不豐富，用接種環按壓時有少許液體滲出，成熟后灰黑色孢子大量形成。由圖1b可知，菌株000無小梗結構，可看見閉囊殼以及子囊孢子。由圖1C可知，菌株5132在酵母浸出粉胨葡萄糖培養基上28 ℃培養3 d后，質地蓬松且較厚，邊緣呈白色，成熟后整個菌落變為深褐色，不透光呈不規則的邊緣，菌落直徑為1.5～2.0 cm。由圖1c可知，膨大的頂囊以及一輪小梗、二輪小梗等結構。

2.1.2 分離菌株的分子生物學鑒定

利用ITS通用引物ITS1和ITS4進行PCR擴增結果見圖2。由圖2可知，從PCR樣品擴增條帶可以看出，大約位于750 bp位置附近出現亮帶，說明ITS序列擴增成功。

圖2 分離菌株18S rRNA基因PCR擴增產物瓊脂糖凝膠電泳圖Fig. 2 Agarose gel electrophoretogram of PCR amplification products of 18S rRNA gene of isolated strains

將分離得到的3株菌進行18S rRNA基因序列分析，通過將000、621、5132三株菌的序列輸入NCBI中，利用的BLAST功能將同源性相近的其他幾個序列進行同源性比對，并采用MEGA8.0軟件進行序列對比和系統進化樹的構建，結果見圖3。由圖3可知，菌株000與溜曲霉菌JQ257030.1的相似度為100%，菌株621與溜曲霉菌MH345889.1相似度為100%，菌株5132與溜曲霉菌MH244392.1的相似度為99%。因此，菌株000、621、5132均被鑒定為溜曲霉菌（Aspergillus tamarri）。

圖3 分離菌株基于18S rRNA基因序列系統進化樹Fig. 3 Phylogenetic tree of isolated strains based on 18S rRNA gene sequences

2.2 三株菌蛋白酶、纖維素酶及脂肪酶活力測定

以酪氨酸質量濃度（x）為橫坐標，吸光度值（y）為縱坐標；以葡萄糖質量濃度（x）為橫坐標，吸光度值（y）為縱坐標；以油酸質量濃度（x）為橫坐標，吸光度值（y）為縱坐標，分別繪制酪氨酸、葡萄糖及油酸標準曲線。得到酪氨酸標準曲線回歸方程y=0.002 9x+0.044 9，相關系數R2為0.999 2；葡萄糖標準曲線回歸方程y=0.024 1x+0.008 8，相關系數R2為0.998 9。油酸標準曲線回歸方程y=0.135 1x+0.023 8，相關系數R2為0.996 1，分別按照標準曲線回歸方程及計算公式計算蛋白酶、纖維素酶及脂肪酶酶活，結果見表1。

表1 三株溜曲霉的酶活比較Table 1 Comparison of enzyme activities of 3 strains of Aspergillus tamarii

在以蛋白質為主要成分的大豆制品中，蛋白酶能催化蛋白質水解生成多肽及小分子氨基酸以及各種香氣成分[19-21]，其活性高低也反映了豆豉中蛋白質水解的速度，決定了豆豉發酵成熟的周期。因此，蛋白酶活性是評價豆豉發酵過程中的一項重要指標。由表1可知，菌株0000、621和5132的蛋白酶活力分別為（5.00±0.01）U/mL、（207.98±3.20）U/mL、（175.73±1.32）U/mL，菌株0000蛋白酶活力明顯低于其余兩者且很弱，其中最高的菌株621的酶活力與任璐等[11]從永川豆豉與三臺豆豉中分離得到的2株總狀毛霉中最高蛋白酶活力176.891 U/mL相比要高31.09 U/mL。

纖維素酶活力高低在豆豉發酵的過程中決定著大豆纖維的降解速度，大豆纖維素的降解會降低豆豉的硬度、彈性以及咀嚼度等質構指標[22]，不僅有利于后續發酵還使豆豉具有入口化渣的口感。根據表1可知，菌株000、621、5132的纖維素酶活力差距較小，其中以菌株5132的纖維素酶活力最高為（3.40±1.40）U/mL，與彭昀等[23]從慶陽豆豉中分離得到的菌株的纖維素酶活力（最高的可達到6.015 U/mL）相比較低，張洪勛[24]在1992年首次提出了一株產果膠酶的溜曲霉827，此菌也具有產纖維素酶和半纖維素酶的能力。

大豆作為油料，脂肪含量較高，管泳宇等[25]對曲霉型豆豉發酵過程研究中發現豆豉脂肪含量最高可達到27.31 g/100 g，脂肪酶在豆豉發酵過程中也起著很大的作用，由于脂肪降解產物中的C5～C11不飽和脂肪酸是豆豉中揮發性風味物質的主要成分之一[26]，因比脂肪酶活性與豆豉風味的形成密切相關。由表1可知，菌株000、621、5132的脂肪酶活力差距不大，以菌株000脂肪酶活力為（90.07±0.64）U/mL最高，與廖焰焰等[27]從南昌稻香元曲霉型豆豉中分離出1株脂肪酶活力為30 U/mL的米曲霉相比高60.7 U/mL。

綜上，在瀏陽豆豉所分離的3株菌中，菌株621蛋白酶酶活力最強為（207.98±3.20）U/mL，可考慮用作豆豉、腐乳、豆渣等或者高蛋白飼料發酵用菌[28-29]。菌株5132纖維素酶活力最高為（3.40±1.40）U/mL，由于纖維素酶可以分解包裹蛋白質的纖維素，因此可以考慮作為作物類快速發酵用菌[30]。3株菌脂肪酶活力平均值為88.78 U/mL，其中以菌株000最高為（90.07±0.64）U/mL，可以進一步探索是否可作為蛋奶制品等高脂肪食品的發酵用菌。

3 結論

本研究從傳統發酵的瀏陽豆豉中分離出3株菌，對其進行ITS rDNA基因序列分析，經測序、序列提交到GenBank數據庫利用BLAST工具進行序列比對后，結果表明，菌株000、5132、621分別為溜曲霉（Aspergillus tamarri）JQ257030.1，溜曲霉（Aspergillustamari）MH244392.1及溜曲霉（Aspergillus tamari）MH345889.1。菌株000、621、5132均具有不同程度的產蛋白酶、纖維素酶及脂肪酶活力。其中菌株621蛋白酶酶活力最高為（207.98±3.20）U/mL，菌株5132產纖維素酶活力最高為（3.40±1.40）U/mL，菌株000產脂肪酶活力最高為（90.07±0.64）U/mL。本研究從瀏陽豆豉中分離純化出3株優勢溜曲霉菌，并對其產酶能力進行評價，為傳統豆豉工業化生產菌種的選育以及對菌株的開發利用提供了科學理論依據。