米粉生產過程中大米發酵液的菌相變化研究

熊香元，歐陽雅琦，張立釗，陳力力*，周 玥，龔慧可

（1.湖南農業大學 食品科學技術學院，湖南 長沙410128；2.食品科學和生物技術湖南省重點實驗室，湖南 長沙410128）

鮮濕發酵米粉是我國南方地區特色美食之一，口感爽滑、味道鮮美且食用便捷，深受消費者喜愛[1]。鮮濕發酵米粉經大米浸泡（發酵）、清洗、磨漿、熟化、成型、蒸粉、冷卻、包裝等工序制成[2]。中國南方常用“續渣法”發酵米粉，即將前次發酵液按適量比例接種至新鮮原料中，這種發酵方式能促進發酵，減少發酵時間[3]。發酵過程中微生物產生酸和酶等代謝產物改變大米化學成分，提高米粉蒸煮和食用品質。目前，已有學者對發酵米粉中微生物菌群組成進行了相關研究，然而不同地區樣品研究結果不盡相同。LU Z H等[4]分離純化發酵米粉中的微生物，發現米粉發酵液中優勢菌群為乳酸桿菌（Lactobacillus）、乳酸鏈球菌（Streptococcus lactis）、酵母菌；馬霞[5]從大米發酵液中分離得到1株優勢菌株，經形態學特征、生理生化特性及16S rDNA基因序列分析鑒定其為乳酸乳球菌（Lactococcus lactis）。傳統自然發酵米粉的發酵過程主要由自然環境和“續渣液”中微生物發酵完成，微生物種群的復雜和不確定性造成發酵時間隨季節變化較大，企業生產產能效率受限，經濟效益下降，發酵米粉規范管理和生產過程標準化進程緩慢。因此，無論是出于發酵條件優化，還是食品安全控制方面考慮，了解大米生產過程中發酵液菌相變化顯得十分重要。

在發酵食品生產過程中，發酵微生物（優勢菌）數量變化是決定發酵產品質量的重要指標，傳統微生物菌落平板計數法費時費力且滯后，起不到預測作用[6]，而預測微生物學能有效規避這些缺點。預測微生物學是一門交叉性學科，包含了數學、化學、微生物學和計算機技術等內容，將微生物數量變化趨勢通過數學方法表達出來，不僅能預測發酵食品中優勢菌生長規律，還能監測有害菌的生長變化，保證食品的發酵周期和安全性[7]，從而為其進一步研究提供依據。預測微生物學常采用Exponential-linear模型、Logistic模型、Gompertz模型等基礎數學模型，其中Gompertz模型能較好的預測微生物的生長趨勢，Gompertz曲線呈S型，其形態特征是前后兩段緩慢增長期中間夾著一段快速增長期，最具有代表性[8]；修正的Gompertz模型可以描述一定環境下微生物數量隨時間變化的關系[9]。目前，國內外利用Gompertz模型對食品基質中微生物生長模型的建立已有相關報道。劉亞兵等[10]運用Gompertz模型在冷卻牛肉中建立了假單胞菌生長模型，有效地預測了冷卻牛肉的貨架期；LEE Y J等[11]運用Gompertz模型擬合了豬肉中金黃色葡萄球菌的生長曲線。Gompertz模型常應用于預測食品貨架期[12]，而應用于預測米粉發酵過程中優勢菌生長趨勢的報道較少。

本研究基于鮮濕發酵米粉生產工藝，探究不同發酵時期大米發酵液中微生物種類及其數量變化規律，并運用修正的Gompertz模型[13]，采用統計學軟件擬合微生物生長動力學模型，為進一步研究鮮濕發酵米粉生產過程中優勢菌及其作用，提高生產效率，控制發酵周期，推進鮮濕發酵米粉標準制定奠定理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 材料

以湖南鮮濕米粉生產廠自然發酵大米發酵液作為試驗材料，采集發酵0～4 d大米發酵液樣品5組各3份，分別裝入無菌采樣瓶中，并編號0d1、0d2、0d3、1d1、1d2、1d3、2d1、2d2、2d3、3d1、3d2、3d3、4d1、4d2、4d3，帶回實驗室后置于冰箱保存，20 h內檢測處理。

1.1.2 培養基

平板計數瓊脂（plate count agar，PCA）培養基、MRS培養基、腸球菌培養基、孟加拉紅培養基、結晶紫中性紅膽鹽葡萄糖瓊脂（violet red bile glucose agar，VRBGA）培養基：北京陸橋生物技術有限責任公司。

1.2 儀器與設備

SW-CJ-1FD單人單面凈化工作臺：蘇州凈化設備有限公司；SPX-250BⅢ恒溫培養箱：上海新苗醫療器械制造有限公司；FE28-pH計：梅特勒-托利多儀器有限公司；LDZX-50KBS立式高壓蒸汽滅菌鍋：上海申安醫療器械有限公司；CX23LEDRFS1C-生物顯微鏡：日本奧林巴斯工業有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 大米發酵液可培養微生物分離和計數

將發酵液樣品按10倍梯度稀釋后，取適當濃度的樣品懸液，根據GB 4789.2—2016《食品安全國家標準食品微生物學檢驗菌落總數測定》[14]、GB 4789.35—2016《食品安全國家標準食品微生物學檢驗乳酸菌檢驗》[15]、GB 4789.15—2016《食品安全國家標準食品微生物學檢驗霉菌和酵母計數》[16]、GB 4789.41—2016《食品安全國家標準食品微生物學檢驗腸桿菌科檢驗》[17]、葡萄球菌和微球菌的方法[18]分別對菌落總數、乳酸菌、霉菌酵母菌、腸桿菌和球菌進行培養和計數。

1.3.2 典型微生物形態特征觀察

觀察各培養基平板中微生物的菌落大小、顏色、形態、質地、光澤、隆起度、透明度和邊緣結構等菌落形態，并對典型的細菌菌落和真菌菌落分別進行革蘭氏染色和美藍染色[19]，于光學顯微鏡下觀察其細胞形態和排列方式等菌體形態特征。

1.3.3 不同時期大米發酵液pH值的測定

采用pH計分別測定發酵0 d、1 d、2 d、3 d、4 d的大米發酵液的pH值，每個樣品重復測定3次。

1.3.4 微生物生長動力學模型擬合[13]

采用Origin 9.0和SPSS25.0對可培養微生物試驗數據結果進行統計，根據修正的Gompertz模型擬合微生物生長動力學模型，利用一級模型描述發酵時間與生物量的關系。修正的Gompertz模型如下：

式中：t為發酵時間，d；Nt為微生物在發酵時間t時的菌落總數的對數值，lg（CFU/mL）；A為初始菌落數的對數值，lg（CFU/mL）；C為隨發酵時間無限增加時微生物增量的對數值，lg（CFU/mL）；B為在發酵時間M時的相對最大比生長速率，d-1；M為達到相對最大比生長速率的所需時間，d。

其方程式是雙指數函數，是一個非線性的微生物生長模型。根據該函數參數與微生物參數互換后可得出微生物生長的最大比生長速率v（d-1）、微生物生長遲滯期（lag-phase duration，LPD）（d）和微生物生長穩定期菌落總數的最大對數值Nmax（lg（CFU/mL）），其換算公式如下：

v=BC/e（e=2.7182）；LPD=M-（1/B）；Nmax=A+C。

2 結果與分析

2.1 可培養微生物形態特征

從選擇性培養基中挑取典型菌落進行編號，觀察菌落形態和菌體形態特征。在MRS培養基上共挑取了3種不同特征的菌落，分別編號為R1、R2、R3；在孟加拉紅培養基上挑取類似霉菌和酵母的典型菌落，分別編號為M1、M2、J1；在腸球菌培養基上挑取典型菌落，分別編號為Q1、Q2；部分菌株的菌落大小、顏色、形態、質地、光澤、隆起度、透明度和邊緣結構等和顯微鏡下細胞形態和排列方式見圖1，具體描述見表1。

圖1 部分典型菌落的菌落形態（A）及細胞形態（B）Fig. 1 Colony morphology (A) and cell morphology (B) of partial typical colonies

由圖1及表1可知，大米發酵液中微生物種類豐富，細菌主要為革蘭氏陽性無芽孢菌，酵母菌形態單一，均呈圓形。米粉發酵過程中存在的乳酸菌可能為乳球菌和乳桿菌，這與前人報道一致[20]；乳酸菌代謝產生的酸和酶具有消化淀粉、糖、蛋白質或脂肪的能力，對大米淀粉純化提升米粉品質有著積極作用。LI N等[21]研究表明，乳酸菌發酵大米中蛋白質、脂肪、淀粉等含量發生變化，米粉彈性增強、吐漿率降低，口感柔韌順滑。

表1 不同選擇性培養基典型菌落的菌落及細胞形態特征Table 1 Colony and cell morphological characteristics of typical colonies in different selective media

2.2 可培養微生物數量及變化規律

米粉發酵過程中大米發酵液微生物數量及變化規律見表2。

表2 大米發酵液微生物數量及其變化規律Table 2 Quantity and change rule of microorganisms in rice fermentation broth

由表2可知，大米發酵液中菌落總數和真菌菌數變化趨勢相似，呈先上升后下降或發酵后期趨于平穩的趨勢。發酵0 d時菌落總數最大，乳酸菌次之，分別為2.79×107CFU/mL、2.50×106CFU/mL。發酵前期原料、環境和操作人員等因素造成菌落總數最高；發酵前加入的8%“續渣液”中主要菌群可能為乳酸菌，使得發酵0 d時乳酸菌菌落數較大。發酵1 d后各種微生物適應環境，菌落總數、乳酸菌菌數、霉菌酵母菌數均增加一個數量級；霉菌酵母培養基上霉菌數量較少，以酵母菌為主。從菌落平板計數結果來看，大米發酵液中乳酸菌和酵母菌數量最多，是大米發酵過程中的優勢菌。乳酸菌代謝產生的乳酸能與酵母菌產生的酒精結合成乙酸乙酯，賦予米粉良好的香氣[22]。發酵0～1 d，乳酸菌快速增長，此時乳酸菌適應發酵環境，誘導酶和有關中間代謝產物都已完全合成，酵母菌所產生的氨基酸和維生素能為乳酸菌的生長提供營養物質[23]。發酵2 d后乳酸菌數量增多，菌落總數增長趨于平緩，真菌、腸球菌數量減少。發酵2～4 d，乳酸菌增長速率相對放緩，這可能是隨著發酵時間延長，乳酸菌作為發酵液中優勢菌增長迅猛，與其他菌群爭奪營養物質，在這種競爭環境下酵母菌數量逐漸減少，假絲酵母、釀酒酵母等酵母菌含有許多酶類如糖化酶、淀粉酶等，能將淀粉轉化為單糖直接為乳酸菌提供營養物質[24]。酵母菌數量下降使乳酸菌可直接利用的營養物質減少和代謝產物積累出現反饋抑制作用導致乳酸菌增長速率緩慢。

可培養微生物數量不僅與發酵時間有關，同時受環境pH值影響。由表2亦可知，菌落總數發酵前期增長速率大于發酵中后期，發酵前期發酵液處于中性環境適合各類微生物生長，菌落總數快速增加；發酵后期菌落總數增長速率不如乳酸菌，一方面是因為隨著乳酸菌數量的急劇增加，發酵液中有機酸含量大量積累，低pH值環境不適合于大多數微生物生長，其他微生物生長緩慢或受到抑制；另一方面乳酸菌代謝產生的抗菌肽，如細菌素，具有良好的抑菌作用[25]。發酵1 d后發酵液pH值迅速降低，pH值下降3.26，隨后發酵液pH值變化不大，這與張玉榮等[26]報道一致。這可能是因為乳酸菌大量繁殖使發酵罐成為高密度環境，此時乳酸菌代謝產物積累和反饋抑制作用，乳酸菌產酸量達到峰值，發酵液中pH值不再發生大幅度變化[27]。前人報道酵母菌主要提高米粉的風味，乳酸菌提高米粉的食用品質[28]，因而控制發酵時間和發酵環境中乳酸菌和酵母菌比例對發酵米粉品質有著重要作用。

2.3 菌落總數及乳酸菌生長動力學模型擬合

采用Gompertz模型，運用Origin9.0繪圖軟件對大米發酵液中的菌落總數及乳酸菌隨時間變化情況進行擬合。利用Gompertz模型擬合菌落總數及乳酸菌生長預測曲線見圖2，菌落總數及乳酸菌數生長預測曲線所對應的數學方程和模型參數分別見表3、表4。

Gompertz一級模型是專門用來描述微生物生長的函數，模型的決定系數R2描述了實驗擬合參數的相關性，系數越接近1表示擬合度越高，參數之間的相關性越好[29]。由表3可知，菌落總數和乳酸菌總數的擬合度判定系數R2分別為0.953 5和0.999 2，擬合度判定系數R2值較高，均＞0.95，說明Gompertz模型能很好的描述菌落總數和乳酸菌的生長曲線，以此生長動力學預測曲線為依據，可預測米粉生產過程中發酵液中菌落總數和乳酸菌的數量。方程擬合的初始菌落總數及乳酸菌數的對數值分別為7.51、6.43，最大菌落總數及乳酸菌數在第4天，分別為8.40、8.41，且由方程可以判斷出發酵3 d時發酵液中菌落總數和乳酸菌數量相當。

圖2 菌落總數（a）及乳酸菌（b）生長曲線擬合Fig. 2 Growth curve fitting of total bacterial count (a) and lactic acid bacteria (b)

表3 菌落總數和乳酸菌的生長動力學方程Table 3 Growth kinetics equations of total bacterial count and lactic acid bacteria

表4 菌落總數和乳酸菌生長動力學參數Table 4 Growth kinetic parameters of total bacterial count and lactic acid bacteria

由表4可知，乳酸菌的LPD值較菌落總數大，說明米粉發酵液中乳酸菌的延滯期較菌落總數長，這可能是由于發酵初期營養物質豐富，發酵液環境適宜，其他細菌迅速繁殖。乳酸菌的v值和M值均大于菌落總數，這說明乳酸菌最大比生長速率大于菌落總數，而達到最大比生長速率時間較菌落總數稍晚，但兩者B值相差不大，說明在到達最大比生長速率時的相對最大比生長速率相差不大。發酵時間對米粉品質有重要作用，發酵時間過短，乳酸菌和酵母菌等微生物菌體濃度不夠，對大米中碳水化合物發酵能力不強，米粉品質達不到要求；而長時間發酵的大米有酸味和腐敗臭味，影響米粉品質[30]。

3 結論

本試驗以不同發酵時間大米發酵液為研究對象，測定不同發酵時期發酵液中微生物菌落數量，并利用修正的Gompertz模型對菌落總數和乳酸菌總數進行一級擬合。平板計數結果表明，米粉生產過程中大米粉發酵液中數量最高的微生物為乳酸菌和酵母菌，修正的Gompertz模型對菌落總數和乳酸菌總數具有較高的擬合度，判定系數R2均＞0.95。經擬合得出，菌落總數和乳酸菌總數的最大比生長速率分別為0.657 d-1、1.418 d-1，延滯期（LPD）分別為0.023 d、0.224 d，穩定期最大菌落數對數值分別為8.40、8.41。利用該模型可預測發酵液在不同發酵時間的乳酸菌及菌落總數變化趨勢，這對不同階段發酵液環境條件控制、米粉質量監控及保鮮儲存等都有非常重要的意義。