廣西生榨米粉中益生乳酸菌的篩選及鑒定

李仁芳，蒙曉明，黃福衛，孫 寧*，黃 麗，楊 攀，李 玲

（1.皇氏集團華南乳品有限公司，廣西 南寧530000；2.廣西水牛乳工程技術研究中心，廣西 南寧530000；3.廣西壯族自治區水牛乳質量與安全控制技術工程研究中心，廣西 南寧530001；4.中國農業科學院 廣西水牛研究所，廣西 南寧530001）

生榨米粉是廣西地區具有地方特色的一種傳統發酵食品，其一般以秈米為原料，經過浸泡、磨漿、自然發酵等工序，再將發酵好的米粉團人工壓榨成細條狀，煮熟后即可食用。和普通米粉相比，經過發酵后的生榨米粉口感爽滑筋道，且具有獨特的酸香味，深受廣大消費者所喜愛。2015年，生榨米粉被選入南寧市第六批市級非物質文化遺產名錄，2016年被廣西烹飪餐飲行業協會列為廣西十大米粉之一[1]。已有研究發現，乳酸菌是米粉發酵過程中的優勢菌群，并且是米粉性狀風味發生改變的關鍵因素[2-3]。

鮮米粉發酵過程中的微生物種類具有多樣性，李蕓[4]從米粉浸泡發酵過程中篩選得到32株發酵乳桿菌（Lactobacillus fermentum）、6株植物乳桿菌（Lactobacillusplantarum）、1株熱帶假絲酵母（Candida tropicalis）和1株枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis），確定枯草芽孢桿菌作為優勢菌；閔偉紅等[5]從發酵米粉中篩選出一株桿狀乳酸菌用于改善米粉的品質；李路遙[6]篩選得到大米發酵液中的優勢菌株乳酸乳球菌（Lactococcus lactis）、唾液鏈球菌（Streptococuus salivarius）和植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）；KOBAYASHI A等[7]研究發現，泰國發酵米粉中含有芽孢桿菌、酵母、霉菌和乳酸菌等微生物；UCHIMURA T等[8]研究發現，乳酸菌占總米粉分離細菌的40%～60%，典型的球菌有乳鏈球菌（Streptococcus lactis）、嗜熱鏈球菌（Streptococcus thermophilus）及乳酸片球菌（Pediococcus acidilactici），桿菌主要有嗜酸乳桿菌（Lactobacillus acidophillus）、植物乳桿菌（Lactobacillusplantarum）及羅伊乳桿菌（Lactobacillusreuteri）。由此可見，傳統發酵米粉中存在著優良的自然乳酸菌菌株，可以作為功能乳酸菌的篩選資源，而廣西生榨米粉作為省內尤其在首府南寧深受消費者喜愛的傳統發酵食品，對其功能乳酸菌的分離和益生特性分析鮮有報道，因此挖掘和分析生榨米粉中優勢乳酸菌，可為豐富傳統發酵食品源有益微生物菌菌種庫及其利用提供技術支持。

本研究以廣西傳統發酵食品生榨米粉為材料，對其中所含有的乳酸菌進行分離、篩選和鑒定，并對不同菌株的益生特性進行檢測，以期獲得具有潛在工業化應用價值的優良乳酸菌株。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 樣品

生榨米粉采集自廣西南寧市周邊的3個生榨米粉作坊，來源編號為XC、FD、PM。

1.1.2 化學試劑

放線菌酮（分析純）：北京陸橋技術股份有限公司；2,2'-聯氮-雙（3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸）二銨鹽（2,2'-azinobis（3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid ammonium salt），ABTS）、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）（均為分析純）：美國Sigma Aldrich公司；凝膠瓊脂（分析純）：上海玉博科技有限公司；DL 2000脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）Marker：日本Takara公司；Chelex-100純化DNA提取試劑盒：美國Bio-Rad公司；細菌通用引物27f、1492r：蘇州金唯智生物科技有限公司；2×EsTaqMasterMix（含染料）：康為世紀生物科技有限公司；氯化鈉、碳酸鈣、氫氧化鈉、濃鹽酸、硫酸亞鐵、鐵氰化鉀（均為分析純）：天津市博迪化工有限公司；磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、無水乙醇（均為分析純）：天津市大茂化學試劑廠；三氯乙酸、30%過氧化氫、鄰二氮菲（均為分析純）：成都市科龍化工試劑廠；牛膽鹽（分析純）：廣東環凱微生物科技有限公司。

1.1.3 培養基

MRS肉湯培養基、MRS固體培養基：青島高科園海博生物技術有限公司。

1.2 儀器與設備

Biotek Epoch2微孔板分光光度計：美國伯騰儀器有限公司；SHP-150生化培養箱：上海精宏實驗設備有限公司；PB-10 pH計：德國賽多利斯集團；SW-CJ-2F潔凈工作臺：蘇州安泰空氣技術有限公司；YM 50立式壓力蒸汽滅菌器：上海三申醫療器械有限公司；Biofuge Stratos高速冷凍離心機、LP Vortex Mixer旋渦振蕩器：美國賽默飛世爾科技公司；DYY-6D型電泳儀：北京市六一儀器廠；BIO-RAD C1000 Touch cthemal聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）儀：伯樂生命醫學產品（上海）有限公司；Ose-470p便攜式藍光凝膠成像系統：天根生化科技（北京）有限公司；ME204E分析天平：梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；C21-SDHCB39電磁爐：浙江蘇泊爾股份有限公司。

1.3 方法

1.3.1 乳酸菌的分離

無菌條件下，稱取生榨米粉團核心部分樣品10 g，加入90 mL無菌生理鹽水，渦旋振蕩制備均勻懸濁液。采用無菌生理鹽水依次進行10倍梯度稀釋，獲得10-2～10-7濃度的稀釋樣品。分別取10-3～10-7稀釋度的樣品各0.1 mL涂布于含有0.01%放線菌酮和2%碳酸鈣的MRS固體培養基，37 ℃條件下恒溫厭氧培養至長出菌落。采用接種環挑取有溶鈣圈的單菌落在MRS固體培養基上劃線純化3次。觀察純化后的菌落形態，并對菌株進行革蘭氏染色、過氧化氫酶反應實驗和測定發酵液pH值。

1.3.2 乳酸菌供試菌液的制備

取待測乳酸菌凍存菌液100 μL接種于MRS肉湯培養基中，裝液量6 mL/13 mL，37 ℃靜置培養24 h。按2%（V/V）的接種量接種于MRS肉湯培養基中，裝液量6 mL/13 mL，37 ℃靜置培養24 h，活化至3代，使用磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer saline，PBS）（pH 7.4）調整菌體濃度為1.0×108CFU/mL。

1.3.3 乳酸菌溶血性實驗

將供試菌液劃線于含有5%脫纖維羊血的血瓊脂基礎培養基中，37 ℃培養24 h，觀察平板上菌落生成情況。

1.3.4 乳酸菌耐受性實驗

（1）乳酸菌耐酸性實驗

將供試菌液以2%（V/V）的接種量分別接種于pH值為2.0、2.5的MRS肉湯培養基中，裝液量6 mL/13 mL，37 ℃靜置培養24 h，將發酵菌液涂布于MRS固體培養基上，同時測定其發酵液在波長595 nm處的吸光度值[9]，觀察平板上是否有菌落生成。以未添加供試菌液為對照組，結果以實驗組與對照組的吸光度差值表示。

（2）乳酸菌的膽鹽耐受能力測定

將供試菌液以2%（V/V）的接種量接種于含有0.3%牛膽鹽的MRS肉湯培養基中，裝液量6 mL/13 mL，同時將供試菌液涂布于含有0.3%牛膽鹽的MRS固體培養基上，37 ℃靜置培養24 h，測定其發酵液在波長630 nm處的吸光度值[9]，并觀察固體平板上是否有菌落生成。以未添加供試菌液為對照組，結果以實驗組與對照組的吸光度差值表示。

1.3.5 乳酸菌的體外抗氧化能力測定

樣品處理：供試菌液在4 ℃條件下經8 000 r/min離心30 min，收集發酵上清液，即為菌株胞外分泌物，用0.45 μm的濾膜過濾，放入-80 ℃冰箱保存待測。

DPPH自由基清除能力的測定：胞外分泌物用超純水稀釋10倍，參照文獻[10]所述方法進行測定。

ABTS自由基清除能力的測定：胞外分泌物用超純水稀釋10倍，參照文獻[11]所述方法進行測定。

羥自由基的清除能力測定：胞外分泌物用超純水稀釋2倍，參照文獻[12]所述方法進行測定。

超氧陰離子自由基的清除能力測定：胞外分泌物用超純水稀釋2倍，參考文獻[13]所述方法進行測定。

還原能力測定：胞外分泌物用超純水稀釋5倍，參考文獻[14]所述方法進行測定。

1.3.6 乳酸菌生長和產酸曲線的測定

將供試菌液以2%（V/V）的接種量接種于MRS肉湯培養基，裝液量6 mL/13 mL，37 ℃恒溫培養，每隔2 h測定各菌種發酵液的pH值及OD595nm值，并繪制產酸曲線和生長曲線。

1.3.7 乳酸菌的分子生物學鑒定

采用Chelex-100法[15]提取純菌株的基因組DNA，以其為模板，參照文獻[16]的方法對篩選菌株的16S rDNA序列進行PCR擴增，PCR擴增引物為細菌通用引物27F（5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'）和1492R（5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3'）。PCR擴增條件：94 ℃預變性5 min；94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸90 s，共30個循環；72 ℃再延伸10 min。PCR擴增產物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，Ose-470p便攜式藍光凝膠成像系統成像，委托上海美吉生物醫藥技術有限公司廣州分公司進行測序。測序結果經DNA Star軟件整理，利用數據庫EzBioCloud（http：//www.eztaxon.org/）進行在線比對，選取同源性較高的模式菌株的16S rDNA序列，采用Mega5.0軟件中的鄰接（neighbor joining，NJ）法構建系統發育樹。

1.3.8 統計分析

采用IBM SPSS 20.0進行統計分析和采用Duncan進行單因素方差分析，通過origin 9.1繪制圖表，每個實驗進行3次重復，結果以“平均值±標準差”表示。

2 結果與分析

2.1 乳酸菌的分離純化

經過初步篩選，從3份不同來源的生榨米粉樣品中共分離獲得146株菌株，其中桿菌104株，球菌42株。所有菌株均無芽孢、革蘭氏染色均呈陽性、過氧化氫酶試驗均呈陰性，發酵液pH值為3.70～4.30，參照《乳酸細菌分類鑒定及實驗方法》[17]初步鑒定這146株菌為乳酸菌。

2.2 乳酸菌的溶血性

對146株乳酸菌進行溶血試驗，結果顯示均為γ-溶血，可用于益生菌的篩選。

2.3 乳酸菌的耐受性

通過耐酸試驗和耐膽鹽試驗，從146株乳酸菌中篩選出綜合耐受能力較好的22株菌株，其耐受性結果見表1。

表1 22株菌株的耐受性結果Table 1 Tolerance results of 22 strains

根據飲食結構的不同，人體胃部的pH值維持在3.0左右[18]。此強酸環境下可抑制或殺死乳酸菌，而乳酸菌到達腸道前，必先經過胃酸環境。因此益生菌在人體胃液的條件下是否存活對其是否能夠到達腸道起著決定性作用[19]。由表1可知，22株菌株在pH 2.0和pH 2.5條件下均能存活，都呈現了較強的耐酸性。根據MRS平板結果并參照柳青[19]的研究得出，在pH 2.0環境中，4株菌株長勢良好，18株菌株長勢一般，其中菌株XC21的耐受性顯著低于其他菌株（P＜0.05）。在pH 2.5環境中，20株菌株長勢良好，2株菌株長勢一般，其中菌株FD18的耐受性顯著高于其他菌株（P＜0.05）。除菌株PM01和XC03外，同一菌株在pH 2.5環境中的OD595nm值都低于pH 2.0中，說明菌株在低pH條件下生長受到抑制。分析原因可能是過低pH值下，菌體無法維持自身細胞內pH值的穩定，從而處于低生存狀態，導致生長停滯，甚至衰亡[20]。

從表1亦可知，22株菌株在0.3%膽鹽條件下培養，OD630nm值均＞0.050，說明菌株在0.3%牛膽鹽環境中長勢良好，在添加0.3%牛膽鹽的MSR固體培養基上長勢非常好，菌株布滿平板，都具有很好的膽鹽耐受性。其中菌株PM01、PM25、PM15和PM05的OD630nm值＞1.6，顯著高于其他菌株（P＜0.05）。不同菌株對0.3%牛膽鹽的耐受能力存在差異，分析原因可能是菌株種屬差異或生存環境長期影響所造成[21]。乳酸菌耐受膽酸鹽的能力是其能在腸道中存活的必要條件，因此耐膽酸鹽能力是益生菌微生物的一個重要特征[22]。人體小腸中膽鹽濃度在0.03%～0.30%之間波動，功能菌進入胃腸道后需要有一定的膽鹽耐受性才可有效發揮功效[23]。本試驗中22株菌株有望在腸道消化過程中存活。

2.4 菌株的體外抗氧化能力

2.4.1 菌株胞外分泌物對DPPH和ABTS的清除能力

22株菌株的胞外分泌物對DPPH自由基和ABTS自由基的清除率結果見表2。

表2 22株菌株胞外分泌物對DPPH自由基和ABTS自由基的清除率Table 2 DPPH and ABTS free radical clearance rate of extracellular secretions of 22 strains

由表2可知，菌株PM44和FD13胞外分泌物稀釋10倍后對DPPH自由基和ABTS自由基的清除率均＞85%，顯著高于其他菌株（P＜0.05），表現出強抗氧化能力，這可能與胞外分泌物中含有胞外多糖和生物活性肽有關[24]。此外，DPPH自由基清除率較高的菌株有菌株FD18、PM20、PM22、PM25、PM33、XC08、XC15和XC21，清除率均＞65%，ABTS自由基清除率較高的菌株有菌株PM20、PM22、PM25、PM33、PM43、XC08和XC21，清除率均＞70%。除菌株PM02、FD06和PM05外，有19株菌株的胞外分泌物清除ABTS自由基能力大于清除DPPH自由基的能力，說明這些菌株對ABTS自由基清除能力更強。

2.4.2 菌株胞外分泌物對羥自由基和超氧陰離子的清除能力

22株菌株的胞外分泌物對羥自由基和超氧陰離子的清除率見表3。

由表3可知，22株菌株的稀釋2倍胞外分泌物均具有清除羥自由基和超氧陰離子的能力，但各菌株抗氧化能力差異較大。29株菌株胞外分泌物對羥自由基清除率均＞60%。其中羥自由基清除率＞70%的菌株共有6株，占所有菌株的27.27%，分別是菌株FD06、PM01、PM20、XC03、XC08和XC27。其中，菌株XC08胞外分泌物清除羥自由基能力最強（76.30%），而菌株XC15最弱（46.09%），顯著低于其他菌株（P＜0.05）。超氧陰離子清除率介于45%～55%的菌株共有20株，占所有菌株的90.9%。其中，菌株PM01（55.76%）和PM15（54.55%）胞外分泌物清除超氧陰離子能力最強，顯著高于其他菌株（P＜0.05），而菌株PM04最弱（41.82%），顯著低于其他菌株（P＜0.05）。乳酸菌發酵液清除羥自由基和超氧陰離子這兩者之間并沒有必然聯系，這與黃麗等[25]的研究結果相似，這也反映出菌株發揮清除自由基能力的物質不同，表明乳酸菌抗氧化作用是多種物質綜合作用的結果。

表3 22株菌株胞外分泌物對羥自由基和超氧陰離子自由基的清除率Table 3 Hydroxyl free radical and superoxide anion free radical clearance rate of extracellular secretions of 22 strains

2.4.3 菌株胞外分泌物的還原能力

22株菌株的胞外分泌物的還原能力見表4。

表4 22株菌株胞外分泌物的還原能力Table 4 Reducing capacity of extracellular secretions of 22 strains

由表4可知，菌株XC21、PM22、XC08、PM33表現出較強的還原能力，OD700nm值均＞0.285，顯著高于其他菌株（P＜0.05）。菌株FD06、PM44、XC27、FD13和PM04的還原能力較弱，OD700nm值均＜0.230，顯著低于其他菌株（P＜0.05）。

乳酸菌通過清除自由基、螯合金屬離子、抑制脂質過氧化、耐H2O2、提高抗氧化酶活力等多種機制發揮抗氧化作用，一種體外評價方法只能根據某一種抗氧化原理評價其抵抗氧脅迫的能力，因此需要采用多種方法進行綜合判斷[26]。綜上抗氧化結果，選取在5個抗氧化測定指標中2個以上指標排前五的代表菌株進行下一步研究，即菌株DF13、PM20、PM22和PM44。

2.5 代表菌株的生長和產酸特性研究

2.5.1 菌株的生長特性研究

由圖1可知，4株菌株的生長趨勢一致，遲滯期為0～2 h，對數生長期為2～10 h，10 h后進入穩定期，生長速率減緩，菌種OD595nm值基本保持恒定。其中菌株PM44在整個生長周期相比其他菌種長勢較快，同時間段內OD595nm值高于其他菌株。在整個生長周期內，4株菌株的生長速度快慢順序為菌株PM44＞FD13＞PM22＞PM20。

圖1 4株菌株的生長曲線Fig. 1 Growth curves of 4 strains

2.5.2 菌株的產酸特性研究

圖2 4株菌株的產酸曲線Fig. 2 Acid production curves of 4 strains

由圖2可知，4株菌株的生長曲線和產酸曲線存在對應關系，隨著菌種生長速率增加，產酸速率同時增加，產酸快慢的規律也和生長曲線一致。同樣的，產酸延滯期為0～2 h，各菌株pH值變化不大；發酵2 h后進入對數生長期，菌體生長代謝旺盛，產生大量有機酸，pH值迅速下降；發酵10 h左右達到生長穩定期，pH值變化不大，其中菌株FD13、PM22、PM20發酵菌液的最終pH值為3.8左右，而菌株PM44的最終pH值為4.0左右。綜上，菌株PM44產酸速率最大且產酸能力最強。

2.6 代表菌株的分子生物學鑒定結果

菌株PM20、PM22、PM44及FD13的系統發育樹見圖3。

圖3 基于16S rDNA基因序列菌株的系統發育樹Fig. 3 Phylogenetic tree of strains based on 16S rDNA gene sequences

由圖3可知，菌株PM20、PM22及FD13與發酵乳桿菌（Lactobacillus fermentum）聚于一支，親緣關系最近，菌株PM44與乳酸片球菌（Pediococcus acidilactici）聚于一支，親緣關系最近。因此，菌株PM20、PM22和FD13被鑒定為發酵乳桿菌（Lactobacillus fermentum），菌株PM44被鑒定為乳酸片球菌（Pediococcus acidilactici）。

3 結論

本研究通過革蘭氏染色、過氧化氫酶試驗及溶血性試驗從廣西生榨米粉中共篩選出146株γ-溶血的乳酸菌；通過耐酸、耐膽鹽性能測定篩選出22株對pH 2.0和0.3%膽鹽均具有良好耐受性的菌株；通過體外抗氧化能力測定篩選出綜合體外抗氧化能力較好的4株優良菌株（PM20、PM22、PM44、FD13）。4株菌株生長及產酸趨勢一致，其中菌株FM44的生產速率及產酸速率最快。通過分子生物學技術鑒定菌株PM20、PM22、FD13均為發酵乳桿菌（Lactobacillus fermentum）、菌株PM44為乳酸片球菌（Pediococcus acidilactici）。