高溫大曲中產四甲基吡嗪細菌的篩選及鑒定

鐘桂芳，張 帆，郭輝祥，周憶菲，馬歌麗，王光路*

（1.鄭州輕工業大學 食品與生物工程學院 食品生產與安全河南省協同創新中心，河南 鄭州450001；2.舍得酒業股份有限公司，四川 射洪629209）

四甲基吡嗪（tetramethylpyrazine，TTMP）又名川芎嗪，屬生物堿類，是一種含氮雜環化合物，廣泛存在于食品原料、咖啡以及乳制品中，具有烘烤香氣、甜香，是中國白酒中的重要香氣化合物之一[1]。除了作為食品風味添加劑提升香氣外，四甲基吡嗪還是中藥川芎的重要活性成分，可用于對疾病的預防[2]。近年來，我國許多白酒企業為提高白酒中四甲基吡嗪含量，開展了如何利用微生物發酵酒曲以及優化條件的研究[3-6]，并已成為研究白酒對人體健康作用的重要部分[7]。

徐巖等[8]研究驗證了中國白酒發酵過程中TTMP的產生主要來源于微生物的代謝反應，而非美拉德反應。比如芽孢桿菌可利用底物合成四甲基吡嗪的前體3-羥基丁酮（又稱乙偶姻），3-羥基丁酮進一步與氨反應生成四甲基吡嗪。陳夢圓等[9]通過固態發酵法從高溫大曲中篩選得到2株高產四甲基吡嗪菌株，分別為地衣芽孢桿菌（Bacillus licheniformis）和暹羅芽孢桿菌（Bacillus siamensis），發酵10 d后產量最高可達（150.92±0.783）mg/L。王曉丹等[10]對產四甲基吡嗪地衣芽孢桿菌（Bacillus licheniformis）進行了研究，結果表明，將篩選得到菌株按最佳添加量5%添加到窖池中層的糟醅中，發酵后的酒醅四甲基吡嗪含量達6.81 μg/g，是對照組的3.03倍。ZHU B F等[11]對從高溫大曲分離得到的利用乙偶姻產四甲基吡嗪的厭氧芽孢桿菌（Bacillussp.）進行了研究，經鑒定為枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）。并對該菌產四甲基吡嗪的發酵條件進行了優化，得到的TTMP產量＞4.08 g/L，為目前最高的報道，同時研究發現高濃度的磷酸氫二銨有利于四甲基吡嗪的產生。

我國醬香型、芝麻香型、濃香型白酒中四甲基吡嗪含量比較高[12-14]，目前大多集中在對醬香型和濃香型白酒中TTMP的研究。本研究通過從高溫酒曲中分離純化菌株，采用氣相色譜-質譜聯用（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）儀篩選出高產TTMP的菌株，通過觀察其菌落形態和細胞形態，結合利用16S rRNA鑒定，對高產TTMP的菌株進行菌種鑒定及揮發性成分分析。旨在增加白酒的風味及保健功能，為高產菌株在濃香型白酒中的應用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 材料

高溫大曲：舍得酒業股份有限公司。

1.1.2 化學試劑

四甲基吡嗪標品（純度98%）：上海源葉生物科技有限公司；二氯甲烷（色譜級）：天津市大茂化學試劑廠；其他試劑均為國產分析純。

1.1.3 培養基

牛肉膏蛋白胨培養基：牛肉膏5 g/L，蛋白胨10 g/L，氯化鈉5 g/L，瓊脂20 g/L，pH 7.0～7.2，121 ℃滅菌30 min。

液體培養基：酵母膏5 g/L，蛋白胨10 g/L，氯化鈉10 g/L，pH 7.0～7.2，121 ℃滅菌20 min。

富集培養基：酵母膏3 g/L，蛋白胨10 g/L，淀粉3 g/L，MgSO4·7H2O 0.01 g/L，KH2PO40.2 g/L，Na2HPO42 g/L，pH 7.8，121 ℃滅菌20 min。

發酵培養基：葡萄糖50g/L，酵母粉10 g/L，蛋白胨30g/L，磷酸氫二銨30 g/L，pH 7.0，121 ℃滅菌20 min，葡萄糖單獨滅菌，115 ℃滅菌20 min。

V-P培養基：6%α-奈酚酒精溶液為甲液，40%氫氧化鉀為乙液。

1.2 儀器與設備

GR85DA型蒸汽滅菌鍋：濟南來寶醫療器械有限公司；SHP-25型恒溫培養箱：上海森信實驗儀器有限公司；Mixer 4k型微型漩渦混合儀：生工生物工程（上海）股份有限公司；RE-52AA型旋轉蒸發儀：上海亞榮生化儀器廠；PX2型聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）儀：上海賽默生物科技有限公司；DYCP-31脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）電泳槽、DYY5穩壓電泳儀：北京六一儀器廠；FR980凝膠成像儀：上海復日科技儀器有限公司；7890A自動進樣氣相色譜質譜聯用儀：安捷倫科技（中國）有限公司；ZQWY-200S型三層組合式全溫振蕩培養箱：上海知楚儀器有限公司；BSA2202S型電子天平：北京賽多利斯儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 產四甲基吡嗪菌株的分離純化

在無菌環境下，稱取10.00 g酒曲樣品加入到100 mL無菌水，37 ℃、200 r/min振蕩30 min。85 ℃水浴加熱30 min，取上清液5.00 mL加入95 mL的富集培養基中，37 ℃、200 r/min振蕩富集處理24 h。將培養好的富集液進行稀釋，配成10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7梯度的菌懸液。吸取10-3、10-4、10-5、10-6、10-7梯度菌懸液各50 μL進行涂布培養，37 ℃倒置培養24 h。挑取平板上不同形態的菌株，將獲得的單菌落進行平板劃線處理，多次純化。將純化好的單菌落進行細菌染色處理，觀察菌落形態以及細菌的形態，去掉重復的細菌，-80 ℃保存菌種。

1.3.2 菌株液態發酵實驗

由文獻[15]可知，四甲基吡嗪發酵體系的前體物質為乙偶姻，在堿性條件下，乙偶姻被氧化為2,3-丁二酮，2,3-丁二酮與肌酸產生粉紅色的復合物。借助V-P實驗[15]進行乙偶姻含量高低初步檢測，實現對產四甲基吡嗪菌株的初篩。

將純化的菌種分別接入含5 mL的液體培養基的試管內，37 ℃、200 r/min培養15～18 h。4%接種量于發酵培養基內，37 ℃、200 r/min培養36 h。取1 mL加入V-P培養基的試管內振蕩混勻，放置5 min，觀察顏色變化。如果顏色不深可再培養一段時間。選取陽性反應的菌株進行高產四甲基吡嗪菌株的復篩。

將經過初篩的菌株繼續培養，47 ℃、200 r/min培養24 h，隨后升至60 ℃，200 r/min培養12 h[16]。然后取10 mL發酵液，用10 mL的二氯甲烷萃取。步驟為：將蒸餾液加入10 mL的二氯甲烷，超聲20 min混合均勻，倒入分液漏斗中，排出氣體，靜置30 min，可明顯看到分層，將下層液體從下方流出，上層液體從上方倒出，再將下方倒出的液體加入10 mL的二氯甲烷進行萃取，重復上述步驟3次，則得到30 mL萃取液，濃縮至1 mL，用氣相色譜-質譜聯用儀測定其TTMP的含量。

1.3.3 高產四甲基吡嗪菌株的鑒定

菌株形態鑒定：將篩選出TTMP產量高的菌株在平板上活化，再以點接法接種到牛肉膏蛋白胨瓊脂培養基上，37 ℃條件下培養48 h后觀察其在培養基上顏色、大小、質地、邊緣整齊性、表面光滑性等菌落形態特征。將保存菌株接種到液體培養基中，在37 ℃、200 r/min條件下培養24 h。將活化后的菌株制片，染色后顯微鏡觀察其菌體形態。

菌株分子生物學鑒定：根據細菌DNA提取試劑盒說明書，采用細菌16S rDNA通用27F（5'-AGAGTTTGATCCGGCTCAG-3'），1492R（5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3'）進行PCR擴增，在25.0 μL聚合酶鏈式反應（PCR）體系中，上、下游引物1492R和27F各1.0 μL，TaqMaster Mix 12.5 μL，細菌DNA 0.5 μL，雙蒸水（ddH2O）10.0 μL。PCR擴增條件為初始變性94 ℃、15 min；然后變性94 ℃、0.5 min，退火55 ℃、0.5min，復性72℃、1.5 min，30個循環，最后延伸72 ℃、10 min，反應結束后4 ℃保存。取5 μl細菌DNA溶液加1 μL Loading buffer于1%瓊脂糖凝膠120 V電泳25～30 min。

測序由上海生物工程有限公司完成，采用16S rRNA鑒定方法對菌株進行分子生物學鑒定。所得測序結果輸入美國國家生物信息技術中心（national center of biotechnology information，NCBI）的GenBank數據庫中進行基本局部比對搜索工具（basic local alignment search tool，BLAST）比對，用鄰接（neighbor-joining，NJ）法構建目標菌株的系統發育樹。

1.3.4 四甲基吡嗪含量的測定[17-19]

四甲基吡嗪含量測定采用氣相色譜-質譜聯用（GCMS）法。

四甲基吡嗪標準曲線的繪制：準確稱取0.05 g（精確到0.000 1 g）的四甲基吡嗪，溶于100 mL的色譜級二氯甲烷，定容至刻度線，配制成500 mg/L的四甲基吡嗪標樣母液。移液管依次移取1 mL、2 mL、3 mL、4 mL、5 mL、6 mL、8 mL 500 mg/L的四甲基吡嗪標樣溶液于10 mL容量瓶中，定容至刻度線，即配制成50 mg/L、100 mg/L、150 mg/L、200 mg/L、250 mg/L、300 mg/L、400 mg/L四甲基吡嗪系列標準溶液。四甲基吡嗪系列標準溶液在選定的色譜條件下測定，以四甲基吡嗪質量濃度（x）為橫坐標、峰面積（y）為縱坐標，繪制TTMP標準曲線。

氣相色譜條件：彈性石英毛細管色譜柱（30 m×0.25 mm×1 μm），柱溫40 ℃（保持1 min），以10 ℃/min升溫至150 ℃，再以10 ℃/min升溫至210 ℃保持10 min，再以20 ℃/min升溫至230 ℃保持4 min，運行時間52 min；汽化室溫度250 ℃；載氣為高純氦氣（He）（純度99.999%）；柱前壓7.334 psi，載氣流速1 mL/min；分流進樣，分流比為20∶1。

質譜條件：電子電離（electron ionization，EI）源，電子能量70 eV，離子源溫度230 ℃，接口溫度250 ℃，四級桿溫度150 ℃，溶劑延遲時間8 min，全掃描。

定性定量方法：采用選擇離子掃描模式對四甲基吡嗪的4個特征離子進行掃描。GC-MS聯用儀得出其峰面積，根據峰面積與含量成正比的關系，通過已建立的濃度-四甲基吡嗪峰面積標準曲線回歸方程，計算篩選菌株產四甲基吡嗪含量。

2 結果與分析

2.1 四甲基吡嗪標準曲線的繪制

應用GC-MS法測定四甲基吡嗪，以四甲基吡嗪質量濃度（x）為橫坐標、峰面積（y）為縱坐標，繪制四甲基吡嗪標準曲線見圖1。由圖1可知，四甲基吡嗪保留時間為14.467min，標準曲線線性方程為y=6E+07x，相關系數為R2=0.9899，表明二者線性關系良好。

圖1 四甲基吡嗪標準曲線Fig. 1 Standard curve of tetramethylpyrazine

2.2 高產四甲基吡嗪菌株的篩選

采用平板稀釋涂布法，從大曲樣品中分離到具有不同特性菌株，接種到牛肉膏蛋白胨培養基中進行活化。通過V-P培養基篩選，將3-羥基丁酮含量作為重要篩選指標，篩選出10株呈陽性反應且顏色較深菌株。將篩選的10株分別接種于發酵培養基中進行發酵培養，經過72 h發酵，檢測各菌株的TTMP產生能力，結果見圖2。由圖2可知，菌株A7、A18四甲基吡嗪產量較高，分別為350.98 mg/L、163.49 mg/L，將兩株高產菌株用于進一步的分析。

圖2 不同菌株產四甲基吡嗪含量的測定結果Fig. 2 Determination results of tetramethylpyrazine contents produced by different strains

2.3 高產四甲基吡嗪菌株的鑒定

2.3.1 菌株的形態學觀察

對篩選出的菌株A7、A18接種于牛肉膏蛋白胨固體培養基上，觀察其菌落形態特征，結果見圖3。由圖3可知，菌株A7菌落呈白色圓形，呈凝膠狀，邊緣整齊，表面呈突起的圓形，有黏性，濕潤。經染色后，細胞形態為短桿狀；菌株A18菌落為白色圓形，邊緣整齊，中間厚邊緣薄，表面粗糙干燥，附著力強。經染色后，細胞形態同為短桿狀。

圖3 菌株A7、A18的菌落形態（A、B）及細胞形態（C、D）Fig. 3 Colony (A, B) and cell (C, D) morphology of strains A7 and A18

2.3.2 菌株的分子生物學鑒定

采用通用引物27F和1492R，利用PCR擴增獲得高產菌株A7和A18的16S rDNA序列，并交由上海生工有限公司進行序列測定。將測得核苷酸序列通過NCBI-BLAST程序在GenBank數據庫中進行比對，選取相關菌種的同源性高的序列。采用MEGA-X軟件進行序列比對，NJ法多序列連配分析后構建系統發育樹，結果見圖4。由圖4A可知，菌株A7與多株芽孢桿菌同源性為99%，與模式菌株甲基營養型芽孢桿菌（Bacillus methylotrophicus）RY1處于同一分支，結合菌落形態分析，可鑒定菌株A7為甲基營養型芽孢桿菌（Bacillus methylotrophicus）。由圖4B可知，菌株A18與多株芽孢桿菌同源性為99%，與模式菌株蛋白水解芽孢桿菌（Bacillus proteolyticus）CBD 119處于同一分支，結合菌落形態分析，可鑒定菌株A18為蛋白水解芽孢桿菌（Bacillus proteolyticus）。

圖4 基于16S rDNA序列分析菌株A7（A）及菌株A18（B）的系統發育樹Fig. 4 Phylogenetic tree of strains A7 (A) and A18 (B) based on 16S rDNA gene sequences analysis

2.4 菌株A7代謝產物的GC-MS分析

對菌株A7進行了模擬液態發酵實驗，發酵72 h后，到達TTMP的最大積累量，同時對發酵成分進行分析。發酵液取10 mL，以5 000 r/min離心10 min以除去菌體，取上清液與二氯甲烷等體積混合后進行蒸餾，收集餾分，對餾分進行GC-MS分析，對其發酵產物的揮發性香味成分進行了測定，其GC-MS檢測總離子流色譜圖見圖5，各成分含量檢測結果見表1。

圖5 菌株A7發酵產物揮發性成分GC-MS分析總離子流色譜圖Fig. 5 Total ion chromatogram of volatile components in fermentation products of strain A7 analysis by GC-MS

表1 菌株A7發酵產物揮發性成分GC-MS分析結果Table 1 Results of volatile components contents in fermentation products of strain A7 analysis by GC-MS

續表

由圖5和表1可知，在菌株A7發酵產物中，吡嗪類化合物相對含量最高，達到了47.05%，其中以四甲基吡嗪為主，相對含量為45.30%。其次是酮類化合物，相對含量為21.76%，其中以3-羥基-2-丁酮（乙偶姻）為主，相對含量為21.54%。醇類化合物相對含量為13.81%，以2,3-丁二醇為主，相對含量為13.79%。酸類物質相對含量為4.08%，醛類物質相對含量為0.46%，酯類物質相對含量為6.85%，還有一些其他的烷烴類和雜環類和未測定出的化合物，總相對含量為4.30%。

3 結論

通過稀釋涂布法，從大曲中分離得到的細菌中有10株菌株具有產四甲基吡嗪的能力。通過模擬液態發酵工藝，梯度升溫發酵，獲得2株液態發酵高產四甲基吡嗪菌株A7和A18，其四甲基吡嗪的含量分別為350.98 mg/L、163.49 mg/L。結合菌株形態學觀察和分子生物學方法，菌株A7被鑒定為甲基營養型芽孢桿菌（Bacillus methylotrophicus），菌株A18被鑒定為蛋白水解芽孢桿菌（Bacillus proteolyticus）。菌株A7液態發酵產物中的揮發性成分GC-MS檢測結果表明，其液態發酵產物中吡嗪類物質含量較高（40.05%）。結合液態發酵產物感官評價，其發酵產物香氣濃郁，這與白酒中風味的特征性成分以吡嗪類等物質為主的說法相符。液態發酵過程相對于固態發酵來說時間短、效率高，適用于實驗室進行小規模篩選高產四甲基吡嗪的菌株。在不同香型白酒中，四甲基吡嗪的含量有所差異，據此可對白酒生產工藝進行改進，提高該組分在白酒中的含量，改善白酒品質[20]。