芽孢桿菌NCB-01胞外蛋白酶酶學特性的初步研究

孫藝軒，鄭國棟，林 劍

（煙臺大學 生命科學學院，山東 煙臺264003）

蛋白酶是非常重要的一種水解酶，在所有的工業酶制劑中，蛋白酶大約占據75%，是最大最重要的工業用酶類之一，蛋白酶制劑的銷售總量占世界酶制劑銷售量的60%以上[1-2]。其中堿性蛋白酶的銷售份額又占整個蛋白酶市場的40%左右，是目前需求量最大的酶類[3]。

海洋因其極端的生存環境，使海洋微生物具有豐富的優于陸生生物的酶基因及物理特性，這些特點極大的促進了人類對于海洋生物新酶源的開發與利用[4]。目前，國內外對堿性蛋白酶產生菌株的篩選主要集中在陸地微生物，而海洋微生物產堿性蛋白酶的研究卻相對較少[5]。近年來，國內外越來越多的學者都相繼開始將目光投向海洋，以期利用海洋環境的特點，從深海微生物中開發出更多新功能蛋白酶類[6-8]。中國科學院海岸帶研究所從渤海海域沉積物中分離得到一枝能夠分泌胞外蛋白酶的菌株7-5，通過對該菌株的形態特征、生理生化、16S rDNA序列比對等系統研究表明該菌株是海洋獨有的芽孢桿菌屬[9]，本研究將其命名為NCB-01。初步研究表明該菌株既能水解酪蛋白又對明膠蛋白具有一定的水解能力，其胞外蛋白酶屬于海洋微生物堿性蛋白酶，搖瓶培養后發酵液中的酶活力可以達到53.09 U/mL，但其酶學性質是未知的。

本研究以菌株NCB-01的發酵液為原料，對其所分泌的胞外蛋白酶經過一系列的分離純化后，對其酶學性質進行了初步研究，以進一步明確該酶的酶學特征，為該蛋白酶的進一步應用研究提供基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌株及海水菌株NCB-01：煙臺大學生物工程實驗室保存；海水：渤海海水經沉積后取用。

1.1.2 試劑

二乙氨乙基（diethylaminoethyl，DEAE）-瓊脂糖凝膠（Sepharose）fast flow（FF）陰離子交換層析柱：北京索萊寶科技有限公司；Tris、酪素等所有常規試劑均為進口或國產分析純。

1.1.3 培養基

種子培養基：酵母提取物0.25%、蛋白胨0.5%，海水配制。

發酵培養基：酵母粉0.25%、酪素1.5%、明膠2.5%，海水配制。

上述培養基均在121 ℃條件下滅菌20 min。

1.2 儀器與設備

UV-5000型紫外可見分光光度計：上海元析儀器有限公司；PHS—3C型酸度計：意大利哈納公司；20PR-52D型高速冷凍離心機：日本HITACHI公司；BONA-GM-18型有機膜分離實驗機：濟南博納生物技術有限公司；SBS-100型數控計滴自動部分收集器：上海滬西分析儀器廠有限公司

1.3 實驗方法

1.3.1 菌株NCB-01種子液及發酵液的制備

種子液的制備：將菌株NCB-01接入種子培養基，在25 ℃、180 r/min下培養24 h，即得種子液。

發酵液的制備：將菌株NCB-01種子液按照接種量10%接入發酵培養基中，在pH 8.0、25 ℃、180 r/min下搖瓶培養72 h，即得發酵液。

1.3.2 酶的分離純化

將發酵液在4 ℃、10 000 r/min條件下離心10 min后取上清液，首先利用截留分子質量30 kDa的聚醚砜（polyethersulfone，PES）超濾膜進行一級超濾得透過液，再利用截留分子質量20 kDa的PES膜進行二級超濾得截留液，酶液濃縮后進行DEAE-Sepharose fast flow陰離子交換層析，收集有酶活性的組分檢測其純度并用于酶學特性研究。

1.3.3 酶反應最適作用溫度

將1 mL酶液與1 mL 2%酪蛋白底物分別在5 ℃、10 ℃、20 ℃、30 ℃、40 ℃、50 ℃、60 ℃、70 ℃、80 ℃、90 ℃水浴中反應10 min，測定酶活力。以最高酶活力為100%，其他條件下酶活力與之相比較，計算相對酶活力，下同。

1.3.4 酶的熱穩定性

將1 mL酶液分別在10 ℃、20 ℃、30 ℃、40 ℃、50 ℃、60 ℃保溫，每個溫度條件下放6個樣品，每隔20 min取出一個樣品管，放入冰水冷卻后測定酶活力，以未經過熱保溫的酶液作為空白對照（100%），計算相對酶活力。

1.3.5 酶的最適作用pH

將純化后的蛋白酶在不同pH 5.0～12.0條件下進行酶促反應以測定其最適pH值。所用緩沖液為：Na2HPO4-CA緩沖液（pH 5.0），Na2HPO4-NaH2PO4緩沖液（pH 6.0、7.0），Tris-HCl緩沖液（pH 8.0），Gly-NaOH緩沖液（pH 9.0、10.0），Na2HPO4-NaOH緩沖液（pH 11.0、12.0）

1.3.6 酶的pH穩定性

將1 mL酶液加入等體積的不同pH緩沖液中，于60 ℃保溫1 h后，按1.3中方法測定剩余蛋白酶的活力。

1.3.7 金屬離子對酶活力的影響

向 酶 液 中 加 入 用 蒸 餾 水 配 制 的Fe3+、Fe2+、Cu2+、K+、Zn2+、Na+、Mn2+、Ca2+、Mg2+的鹽溶液，使金屬離子的終濃度為5 mmol/L，放置1 h后，按1.3中方法測蛋白酶活力。以不加金屬離子的酶液為對照，即設為100%。

1.3.8 蛋白酶抑制劑對酶活力的影響

在酶的最適反應溫度和最適pH條件下，分別加入乙二胺四乙酸（ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA）及苯甲基磺酰氟（phenylmethanesulfonyl fluoride，PMSF）蛋白酶抑制劑，使試劑終濃度分別為1 mmol/L和5 mmol/L，以不加抑制劑的酶液為空白對照（100%）。

1.3.9 表面活性劑對酶活力的影響

向酶液中加入各種表面活性劑，并使各試劑終濃度為：吐溫-20體積分數10%，吐溫-80體積分數10%，TritonX-100體積分數10%，Span-80體積分數10%，十六烷基三甲基溴化銨（hexadecyl trimethyl ammonium bromide，CTAB）5 mmol/L。以不加表面活性劑的酶液為空白對照（100%）。

1.3.10 鹽濃度對酶活力的影響

向酶液中加入一定量的NaCl，使反應體系中NaCl終質量濃度分別為10 mg/mL、20 mg/mL、30 mg/mL、40 mg/mL、50 mg/mL、60 mg/mL、100 mg/mL，分別測定各鹽度下的酶活，以不加NaCl的酶液為對照，此時酶活設為100%。

1.3.11 堿性蛋白酶反應動力學常數的測定

分別配制質量濃度為1.6 mg/mL、2.0 mg/mL、2.5 mg/mL、3.0 mg/mL、5.0 mg/mL、10.0 mg/mL的酪蛋白溶液。向1 mL各酪蛋白溶液中加入1mL的酶液，在最適條件下反應10min，測定酪氨酸濃度，根據Lineweaver-Burk 雙倒數法作圖，可計算出以酪蛋白為底物時的堿性蛋白酶的米氏常數（Km）和最大反應速率（Vmax）。

1.3.12 測定方法

蛋白酶酶活力的測定：采用Folin-酚顯色法測定蛋白酶的活力[10]。蛋白酶酶活定義：在40 ℃、pH 8.0條件下，每毫升液體酶水解酪蛋白每分鐘釋放1 μg酪氨酸所需要的酶量稱為1個酶活力單位（U/mL）。

2 結果與分析

2.1 DEAE-陰離子交換層析

由圖1可以看出，在整個洗脫過程中出現了三個較大的蛋白峰和兩個蛋白酶活力峰。經檢測，蛋白峰處都沒有蛋白酶酶活力，而酶活峰2處雖然有酶活力，但酶活力較低且蛋白含量較高。在0 mol/L NaCl洗脫階段，出現了蛋白酶活力峰1，此處不僅酶活力較高且蛋白含量較少，說明蛋白酶組分并沒有被填料有效的吸附，但雜蛋白是被吸附了的，達到了分離的目的。

圖1 DEAE-Sepharose FF離子交換柱層析圖Fig. 1 Chromatography of DEAE Sepharose FF ion exchange column

2.2 堿性蛋白酶純化結果

表1 菌株NCB-01產堿性蛋白酶的純化步驟及結果Table 1 Purification procedures and results of alkaline protease from strain NCB-01

由表1可知，發酵上清液在經過一級超濾、二級超濾和DEAE-陰離子交換層析后，比活力由最初的838.36 U/mg提高至2 320.85 U/mg，純度提高了2.77倍，酶得率為24.46%，實現了有效的分離純化。

2.3 堿性蛋白酶的最適作用溫度及熱穩定性

2.3.1 堿性蛋白酶的最適作用溫度

圖2 溫度對堿性蛋白酶活性的影響Fig. 2 Effect of temperature on alkaline protease activity

由圖2可知，當溫度低于60 ℃時，酶活力隨著溫度的升高而升高；在溫度高于60 ℃后，酶活力則隨溫度的升高而下降。在60 ℃時酶活力最高，為該酶的最適作用溫度。在40～70 ℃范圍內，酶的活性都較強，相對酶活力都在80%以上。當溫度低于40 ℃時，隨著溫度的降低，酶活力也下降顯著，在20 ℃時已下降至30%左右，但在5 ℃條件下仍保持了12.0%的酶活力，這說明菌株NCB-01所產堿性蛋白酶對海洋低溫環境有一定的適應性。

目前市場上常用的2709堿性蛋白酶其最適作用溫度為50 ℃，在40 ℃條件下保溫2 h后仍保持80%以上的酶活力[11-12]。這與本實驗中菌株NCB-01所產堿性蛋白酶的性質相近，說明菌株NCB-01所產堿性蛋白酶也可進一步投入生產。

2.3.2 堿性蛋白酶的熱穩定性

圖3 堿性蛋白酶的熱穩定性Fig. 3 Thermostability of alkaline protease

由圖3可知，該堿性蛋白酶分別在10～40 ℃水浴條件下保溫2 h，具有80%以上的酶活力，說明該酶在此溫度范圍內具有良好的熱穩定性。尤其在10～30 ℃保溫2 h，酶活力基本沒有損耗，殘余酶活達到95%及以上。在20 ℃時，隨著在水浴中保溫時間的增長，該堿性蛋白酶的酶活力沒有下降反而有所上升，保溫60 min后，酶活力提高了12.32%。可能是因為在該溫度下，底物與酶的空間結構更加契合，促進了二者之間的反應，在一定程度上提高了該酶的酶活力。在50 ℃下該酶也具有較好的熱穩定性，隨著保溫時間的增長，酶活力逐漸降低，2 h后殘余酶活力為70.94%。而當溫度達到60 ℃時，該酶的熱穩定性很差，在20～30 min達到了半衰期，保溫40 min后，殘余酶活僅為13.84%。

由以上結果可知，雖然該堿性蛋白酶的最適反應溫度為60 ℃左右，但其在低溫下仍具有良好的熱穩定性，這就使得該酶具備了低溫蛋白酶的特性，說明菌株產蛋白酶的熱穩定性與菌株生長的環境溫度密切相關[13]，這就為常溫條件下或者低溫條件下使用該酶創造了條件。

2.4 堿性蛋白酶的最適作用pH及穩定性

2.4.1 堿性蛋白酶的最適作用pH

由圖4可知，當pH值＜8.0時，酶活力隨pH值的升高而升高；當pH＞8.0時，酶活力隨pH的升高而降低。當pH 8.0時，酶活力最高，因而該蛋白酶的最適作用pH值為8.0左右，屬于堿性蛋白酶，這體現了其對海洋弱堿性生態環境的適應。且在pH 7.0～10.0范圍內，酶活力較高，相對酶活力均在75%以上，說明該酶為具有較寬pH值范圍的堿性蛋白酶，因而在洗滌、制革及絲綢等領域具有潛在的商業價值。在pH為12.0的強堿環境中，該酶仍保有一定酶活力，其殘余酶活力為41.14%。而在pH值為5.0的弱酸性條件下，酶活力則較低，相對酶活僅為24.24%。

圖4 pH值對堿性蛋白酶活性的影響Fig. 4 Effect of pH on alkaline protease activity

2.4.2 堿性蛋白酶的pH值穩定性

由圖5可知，在pH值7.0～9.0范圍內，該堿性蛋白酶具有良好的穩定性，其相對酶活性均在90%以上，酶活力損失很小。在pH值高于9.0后，酶穩定性隨pH值的升高逐漸降低，但在極堿條件（pH 12.0）下，其殘余酶活仍有62.88%。說明該堿性蛋白酶在堿性環境中較為穩定。而當pH值低于7.0時，酶的穩定性明顯降低，在弱酸性條件（pH 5.0）中保溫1 h后，其殘余酶活僅為30.0%，說明該堿性蛋白酶在酸性條件下的穩定性較差。

圖5 pH值對堿性蛋白酶穩定性的影響Fig. 5 Effect of pH value on alkaline protease stability

2.5 金屬離子對堿性蛋白酶活性的影響

由圖6可知，不同的金屬離子對該堿性蛋白酶的影響不同。在5 mmol/L的濃度下，Fe3+、Cu2+、Zn2+對酶活性均有抑制作用，且Zn2+的抑制作用最強，可以抑制70%的活性，Cu2+能抑制40%的活性，而Fe3+的抑制作用較弱，僅為12%。Fe2+、K+、Na+、Mn2+、Ca2+、Mg2+能夠不同程度的促進酶活性，且Fe2+、K+、Mn2+、Ca2+的激活作用較明顯，其中Ca2+的激活作用最強，可以使酶活性提高約40%，其他三種離子也能使酶活提高約13%～20%。由細菌產生的堿性蛋白酶在Ca2+、Mg2+或Mn2+存在時可以提高酶的活性和熱穩定性，說明這些金屬離子在高溫下防止變性時具有一定作用，能夠防止蛋白酶催化活性中心構象的改變[14]。Na+、Mg2+的促進作用不明顯，對酶活性影響不大。

圖6 不同金屬離子對蛋白酶活性的影響Fig. 6 Effect of different metal ions on alkaline protease activity

2.6 蛋白酶抑制劑對酶活力的影響

兩種抑制劑乙二胺四乙酸（EDTA）和苯甲基磺酰氟（PMSF）對酶活影響結果見表2。

表2 不同的蛋白酶抑制劑對堿性蛋白酶活力的影響Table 2 Effect of different protease inhibitors on alkaline protease activity

由表2可知，EDTA對酶活性的抑制作用較弱，當其濃度為5 mmol/L時，酶活力仍有88%，沒有被完全抑制。說明金屬離子對酶活力有一定的作用，但不是蛋白酶水解蛋白所必須的。該堿性蛋白酶中可能有共價的金屬離子存在，這些金屬離子被螯合劑剝奪從而導致酶活下降。這與2.5中結果只有部分金屬離子激活酶活性一致。PMSF對該蛋白酶有強烈的抑制作用，當其濃度為5 mmol/L時，抑制率就達到了90%以上。PMSF對絲氨酸有專一性[15]，說明該堿性蛋白酶的活性中心含有絲氨酸殘基，因此該蛋白酶屬于絲氨酸蛋白酶類。PMSF能有效抑制酶的活性，從而能夠阻遏其斷裂大分子蛋白質中的肽鍵，這也能證明蛋白酶大分子間的正確折疊與加工[16]。

2.7 表面活性劑對堿性蛋白酶活性的影響

由圖7可知，非離子型表面活性劑Tween-20、Tween-80及TritonX-100對該堿性蛋白酶均有較強的抑制作用，且抑制作用強弱為TritonX-100＞Tween-80＞Tween-20。TritonX-100可能是對酶活性中心區域的疏水區產生了破壞作用，從而導致酶活力的下降[17]。Tween-20和Tween-80可能使蛋白質分子之間發生反應或吸附聚集而使酶活下降[18]。同樣是非離子型表面活性劑，Span-80對酶幾乎沒有影響。陽離子表面活性劑十六烷基三甲基溴化銨（CTAB）對酶活性的抑制作用較為明顯，使酶活減小了近一半，可能是CTAB與酶聚合形成復合物從而使酶活下降。

圖7 表面活性劑對堿性蛋白酶活性的影響Fig. 7 Effect of surfactants on alkaline protease activity

2.8 鹽濃度對蛋白酶活性的影響

因菌株NCB-01來源于渤海沉積物，因此該菌株所產蛋白酶的耐鹽性值得研究。如圖8所示，在NaCl質量濃度為0～100 mg/mL范圍內，蛋白酶的活力隨鹽濃度的不斷升高而逐漸降低，但仍保持了較高的酶活力。當鹽濃度為100 mg/mL時，其殘余酶活力仍有73.2%。說明該堿性蛋白酶具有良好的耐鹽性，從而體現了菌株NCB-01對海洋環境的適應性。這與深海菌株Exiguobacteriumsp.SWJS2所產蛋白酶具有一定的耐鹽性相一致[19]。

圖8 NaCl質量濃度對堿性蛋白酶活性的影響Fig. 8 Effect of NaCl mass concentration on alkaline protease activity

2.9 堿性蛋白酶動力學常數的測定

米氏常數（Km）是常用的酶的反應動力學常數，它表示酶反應速率（V）為最大反應速率一半時的底物濃度，其大小只與酶的性質有關，而與酶的濃度無關，Km值越小，表示酶與底物的親和力越大。如圖9所示，采用Lineweaver-Burk法，以1/[S]為橫坐標，以1/V為縱坐標作圖，直線的斜率為Km/Vmax，截距為1/Vmax，由此可計算得出，當以酪蛋白為底物時，該堿性蛋白酶的米氏常數（Km）為1.11 mg/mL，最大反應速率（Vmax）為91.74 μg/（min·mL）。說明該堿性蛋白酶與酪蛋白的親和力好，特異性強。

圖9 堿性蛋白酶水解酪蛋白的Lineweaver-Burk圖Fig. 9 Lineweaver-Burk plot of casein hydrolysis by alkaline protease

廣泛應用于食品、洗滌及制革等行業的Alcalase2.4L堿性蛋白酶其米氏常數Km為2.437 mg/mL[20]。而菌株NCB-01所產堿性蛋白酶其Km為1.11 mg/mL，Km值相比Alcalase2.4L更小，說明當以酪蛋白為底物時，菌株NCB-01所產堿性蛋白酶比Alcalase2.4L堿性蛋白酶對蛋白的水解效果更好。

3 結論

該海洋菌株所產蛋白酶具有良好的耐鹽性。雖然其最適溫度為60 ℃，屬于中溫蛋白酶，但在10～40 ℃的低溫條件下具有良好的熱穩定性，最適pH值為8.0，在50 ℃以下的低溫環境中該酶可以較好的保持酶活性，在pH值7.0～9.0的范圍內也可以保持良好的酶穩定性。該酶具有較好的金屬離子耐受能力，Fe2+、K+、Na+、Mn2+、Ca2+、Mg2+對酶活均有不同程度的激活作用。絲氨酸蛋白酶特異性抑制劑（PMSF）能強烈抑制該酶的酶活性，表明該蛋白酶為絲氨酸堿性蛋白酶。非離子型表面活性劑Tween-20、Tween-80及TritonX-100和陽離子表面活性劑十六烷基三甲基溴化銨（CTAB）對酶活均有較強的抑制作用。該酶具有良好的耐鹽性。其米氏常數（Km）為1.11 mg/mL，最大反應速率（Vmax）為91.74 μg/（min·mL），說明該堿性蛋白酶與酪蛋白的親和力好，特異性強。這些優良特性使該蛋白酶在食品、洗滌劑等領域有著潛在應用價值。