一種新型產乙酸乙酯釀酒酵母菌株的構建

任津瑩，馬艷蕊，劉 港，陳葉福，肖冬光

（天津科技大學 生物工程學院 工業發酵微生物教育部重點實驗室，天津300457）

白酒在中國有著源遠流長的歷史，深受人民群眾喜愛，經久不衰[1]。它是以谷糧為制酒原料，酒曲為糖化發酵劑，經蒸餾、貯存和勾調而成[2]，是世界著名六大蒸餾酒之一。酯類是白酒中的主要香氣成分，大多以乙酯形式存在，對白酒風格的形成起關鍵作用。其中乙酸乙酯是清香型白酒的主體香氣成分，適量的乙酸乙酯可以使酒體豐滿、柔和，香氣協調，其含量的高低直接影響清香型白酒的品質[3]。

在傳統清香型白酒的釀造過程中，釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）主要產乙醇，產生的乙酸乙酯很少。產香酵母是產乙酸乙酯的主要發酵微生物，但其產乙醇的能力較低[3-4]。為了獲得一定量的乙酸乙酯，通常會增加糧耗、延長發酵周期。長期采取這種方式效率低、成本高。為了改善這一狀況，構建新型產乙酸乙酯釀酒酵母菌株，使其在發酵過程中保持優良酒精發酵特性的同時生產基礎酯香物質乙酸乙酯，對于白酒產品風味特征的維持與強化，以及白酒質量的提高與穩定具有重要意義。酵母中產酯的途徑主要有兩條，一是通過自身含有的少量酯化酶催化酸和醇直接形成酯；另一條是通過醇酰基轉移酶（alcohol acyltransferase，AAT）將酰基輔酶A中的酰基轉移到醇類底物形成酯，后者是酵母產酯的主要途徑[5]。相關研究表明，醇酰基轉移酶基因ATF1、ATF2的表達水平對乙酸乙酯和乙酸異戊酯的合成影響很大[6-8]。LILLY M等[9]在工業菌株中過表達ATF1基因，以葡萄汁發酵培養基進行發酵，最終葡萄酒中的乙酸乙酯濃度提高了20%～90%，乙酸異戊酯濃度提高了30%～110%。SAERENS S M等[10-11]證明了釀酒酵母中的醇酰基轉移酶EHT1、EEB1在發酵過程中主要負責中鏈脂肪酸乙酯的生物合成，同時對乙酸乙酯這類短鏈酯也有一定的催化活性。目前，國內對釀酒酵母的研究中，大多是對內源醇酰基轉移酶基因進行過表達以提高乙酸乙酯的產量，關于引入外源尤其是綠色植物來源的醇酰基轉移酶基因以達到大幅提高乙酸乙酯產量的研究較少。同時，綠色植物作為一個巨大且豐富的天然AAT庫，存在可開發用于提高釀酒酵母酯合成的潛力。

另一方面，白酒發酵過程中產生的高級醇具有獨特的呈味特征，對酒的風味形成發揮著不可替代的作用[12]。適量的高級醇不僅可以襯托出酯的香氣，賦予酒類特殊的香味，還可以使酒的口感更加柔和、醇厚，給人以圓潤、豐滿、協調的感覺[13]。但高級醇含量過高，會使白酒產生令人不愉快的異雜味[14]，一般白酒中高級醇含量要求＜0.2 g/100 mL（按60%vol計）[15]。此外，高級醇在人體內的氧化速度比乙醇慢，停留時間較乙醇長，其對人體的毒害作用也遠遠高于乙醇。在白酒工業生產中，一般通過改善工藝條件來控制高級醇的產量。孫金旭[16]研究表明，增加大曲用量和添加糖化酶可以降低高級醇的產量。羅惠波等[17]研究表明，適當減少水用量、加糠量以及投糧量，均可以降低高級醇的產生。另外通過代謝工程提升高級醇的利用率，構建新型高產酯低產高級醇的釀酒酵母菌株，也是目前工業微生物育種的研究方向之一[14]。

本研究將來自綠色植物獼猴桃和草莓的醇酰基轉移酶基因AeAT9[18]、VAAT[19-20]分別引入釀酒酵母AY12-α，并通過強啟動子PGK1p對其進行過表達。對獲得的重組菌株進行白酒液態模擬發酵，分析兩基因對釀酒酵母產乙酸乙酯和高級醇的影響，為通過引入外源AAT提高釀酒酵母產酯能力的研究提供理論與實驗參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌株與質粒

本實驗所用菌株和質粒見表1。

表1 實驗中所用菌株和質粒Table 1 Strains and plasmids used in this study

1.1.2 培養基

酵母浸出粉胨葡萄糖（yeast extract peptone dextrose，YEPD）培養基：酵母浸粉10g/L、蛋白胨20 g/L、葡萄糖20 g/L，pH自然，121 ℃高壓滅菌15 min。固體培養基添加瓊脂粉2 g/L。

LB培養基：酵母浸粉5 g/L、蛋白胨10 g/L、氯化鈉10 g/L，pH自然，121 ℃高壓滅菌15 min。固體培養基添加瓊脂粉2 g/L。

半乳糖誘導培養基[21]：酵母浸粉10 g/L、蛋白胨20 g/L、半乳糖20 g/L，pH自然，121 ℃高壓滅菌15 min。

玉米水解液[22]：玉米粉碎顆粒和65～70 ℃的水按料液比1∶3（g∶mL）混合，放置20 min，使顆粒充分吸水膨脹；加入適量液化酶（α-淀粉酶）（2×104U/mL），在85～90 ℃水浴液化1.5 h，每隔一段時間攪拌一次；液化完成后降溫至60 ℃，加入適量糖化酶（1×105U/mL），在55～60 ℃水浴糖化20 h；待糖化液降溫后，用三層紗布過濾，得到澄清濾液即玉米水解液，pH自然，105 ℃滅菌20 min，備用。

一級發酵種子培養基[21]：調節玉米水解液的糖度為8°Bx，加入0.5%酵母浸粉，105 ℃滅菌20 min。

二級發酵種子培養基[21]：調節玉米水解液的糖度為12°Bx，加入0.5%酵母浸粉，105 ℃滅菌20 min。

發酵培養基[21]：調節玉米水解液的糖度為18°Bx，添加MgSO4150 g/L、KH2PO475 g/L、尿素81 g/L，105 ℃滅菌20 min。

1.1.3 主要試劑

酵母浸粉、蛋白胨、瓊脂（均為生化試劑）：北京奧博星生物技術有限公司；葡萄糖（生化試劑）：天津市永大化學試劑開發中心；硫酸鎂、磷酸二氫鉀、尿素、氯化鈉（均為分析純）：天津市北方天醫化學試劑廠；耐高溫糖化酶（2×104U/mL）、液化酶（1×105U/mL）、酸性蛋白酶（5×104U/mL）：丹麥Novozymes公司；PrimeSTAR Max高保真脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）聚合酶、rTaq聚合酶（5 U/μL）、限制性核酸內切酶XhoI（5 U/μL）：大連寶生物工程有限公司；ClonExpressTMⅡ重組克隆試劑盒：南京諾唯贊生物科技有限公司；卡那霉素（kanamycin，Kan）：美國Amreco公司；遺傳霉素（G418）：美國Merck公司；質粒提取試劑盒、DNA純化回收試劑盒、切膠回收試劑盒：北京Solarbio科技有限公司。

1.2 儀器與設備

PCT-200聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）基因擴增儀、DYY-4c電泳儀：美國BIO-RAD公司；Agilent 7890氣相色譜（gas chromatography，GC）儀、Agilent 1100高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）儀：美國安捷倫科技有限公司；Bioscreen全自動生長曲線測定儀：芬蘭Bioscreen公司。

1.3 方法

1.3.1 重組菌株的構建

（1）引物設計

根據美國國立生物技術信息中心（national center for biotechnology information，NCBI）中GenBank數據庫中報道的Gal80、AeAT9、VAAT基因的核苷酸序列，運用Primer 5.0軟件設計實驗中所需的PCR擴增引物，見表2。所有引物均由金維智生物科技有限公司合成。

表2 實驗中所用引物Table 2 Primers used in this study

（2）重組質粒Yep352-PGK（AeAT9）和Yep352-PGK（VAAT）的構建

以Yep352-PGK作為基礎質粒分別構建重組質粒Yep352-PGK（AeAT9）和Yep352-PGK（VAAT），構建流程見圖1。具體方法：在NCBI上分別找到獼猴桃和草莓的醇酰基轉移酶蛋白序列（AIC83789.1、CAC09062.1），并交由蘇州金唯智公司完成釀酒酵母的密碼子優化和基因合成，優化后的AeAT9基因序列如下：

GAAAACAACAGCAGCAACAAAATGGCAAGCTCT GTACGACTAGTGAAAAAGCCTGTCCTGGTCGCTCCCG TAGATCCCACACCGTCCACCGTCCTCTCTCTCTCCTCC CTCGACTCGCAGCTCTTCCTCCGCTTCCCCATCGAGT ACTTACTCGTCTACGCCTCACCCCACGGCGTAGACCG GGCCGTCACTGCTGCTCGCGTAAAGGCTGCTCTTGCT CGAAGCCTGGTGCCTTACTACCCCTTGGCGGGCCGAG TCAAAACCCGGCCAGACAGCACTGGACTCGACGTGG TGTGTCAAGCTCAGGGCGCGGGGTTACTGGAGGCGG TGTCAGATTACACCGCGTCGGACTTTCAACGGGCCCC ACGGTCCGTGACCGAGTGGAGGAAGTTGTTATTGGTT GAGGTTTTCAAAGTAGTCCCGCCACTGGTGGTTCAGC TGACGTGGCTTTCGGACGGTTGTGTGGCTTTGGGGGT TGGGTTTAGTCACTGTGTCATCGACGGCATTGGAAGC TCCGAATTTCTCAATTTGTTCGCTGAGTTAGCCACTG GCAGAGCCAGACTCAGTGAGTTTCAACCCAAACCGG TCTGGGACCGTCACCTTCTCAACTCAGCGGGTCGGAC CAATCTAGGAACTCACCCCGAGTTCGGCCGAGTCCCT GACCTTTCTGGGTTCGTGACACGGTTTACCCAAGAGC GACTCAGTCCCACTTCAATCACATTCGACAAAACATG GCTTAAAGAATTGAAAAATATCGCCATGTCAACGAGT CAACCCGGTGAGTTCCCCTACACGTCGTTTGAAGTTC TCTCAGGTCATATTTGGAGAAGCTGGGCGAGATCGTT AAACTTACCGGCGAAACAAGTTTTAAAGCTTCTCTTC AGTATCAACATACGAAACCGAGTCAAGCCGAGTCTA CCCGCTGGTTACTACGGCAACGCATTCGTACTCGGCT GCGCGCAAACGTCCGTTAAGGACTTAACGGAGAAGG GGTTGGGTTATTGTGCTGATTTAGTGAGGGGTGCGAA GGAGCGAGTCGGGGACGAGTACGCGAGAGAAGTGGT GGAATCGGTGAGTTGGCCGAGGCGGGCGAGTCCGGA CTCGGTGGGCGTGTTGATTATTTCGCAGTGGTCGAGG CTTGGGCTGGACCGGGTTGACTTTGGGCTGGGCAGGC CGGTCCAAGTGGGGCCAATCTGCTGCGATCGGTACTG CTTGTTTCTGCCGGTTCGCGAATCGACGGAGTCCGTG AAGGTGATGGTGGCGGTCCCTACCAGCGCCGTTGATC GATACGAGTATTTTATCAGGAGCCCCTACTCGTGATC ATGATTGGATCGTGGTTCTTTGACTTTTTGTTGTTTGA CTTTTGAATTCTTTTCTTGATGGGTCTTATTCTGCTTC TGATGCAAAGAATTTTATTTTTCTGGGATGTAATCGT CACACCCGAGTTTTGCCCCCCATGTCGGTTGCTTTGTA GGGACACGTGGTGTTTACTAAATGGAAAAAAAATCTA GTGTTA CTATTGCTCAAAAAAAAAAAA

優化后的VAAT基因序列如下：

ATGAACAAAATTGAAGTTTCAATTATTTCTAAGC ATACAATTAAACCATCTACATCTTCTTCACCATTACA GCCATATAAATTGACATTGTTGGATCAATTGACTCCA CCATCTTACGTCCCAATGGTCTTCTTCTATCCAATAAC TGGTCCAGCTGTTTTCAATTTGCAAACTTTGGCAGATT TAAGGCATGCATTGTCTGAAACTTTAACATTGTATTA TCCATTATCTGGTAGAGTCAAAAATAATTTGTATATT GACGACTTCGAGGAGGGTGTCCCATATTTAGAAGCTA GGGTTAACTGTGATATGAACGATTTTTTAAGATTGCC TAAAATAGAATGTTTAAATGAATTTGTTCCAATTAAG CCATTTTCTATGGAAGCTATTTCTGATGAAAGATACC CATTGTTGGGTGTTCAAGTTAATATTTTCAACTCTGGT ATAGCAATTGGTGTTTCAGTTTCACATAAATTGATTGA TGGAAGAACTTCTGATTGTTTTTTAAAGTCTTGGTGCG CTGTTTTCAGGGGTTCTAGAGATAAAATTATTCATCCA AACTTGTCTCAAGCAGCTTTGTTGTTTCCACCAAGAG ATGATTTACCAGAAAAGTATGCAAGACAGATGGAAG GTTTGTGGTTCGTCGGTAAGAAGGTCGCTACTAGGAG GTTCGTCTTCGGTGCTAAGGCTATATCTGTCATTCAGG ATGAGGCTAAGTCTGAGTCTGTCCCAAAGCCATCTAG GGTCCAGGCTGTCACATCTTTCTTATGGAAACATTTG ATTGCTACTTCTAGAGCTTTGACTTCAGGTACTACATC TACTAGATTGTCTATTGCAACACAAGTCGTTAATATT AGATCAAGAAGAAATATGGAAACTGTTTGGGATAAC GCAATTGGTAACTTGATTTGGTTCGCTCCAGCTATTTT GGAATTATCTCACACAACTTTAGAAATATCTGATTTG AAGTTATGTGATTTAGTTAACTTATTGAATGGTTCTGT TAAACAATGTAACGGTGATTACTTCGAAACTTTCATG GGTAAGGAAGGTTATGGATCTATGTGCGAATATTTGG ATTTTCAAAGGACAATGTCATCTATGGAACCAGCTCC AGAAATTTACTTGTTTACTTCATGGACTAACTTCTTTA ATCAATTGGATTTTGGTTGGGGTAGGACATCTTGGAT TGGTGTTGCTGGTAAAATTGAATCTGCTTTTTGCAATT TAACAACTTTGGTCCCAACTCCATGCGACACAGGTAT TGAGGCTTGGGTCAATTTGGAGGAGGAGAAGATGGC TATGTTGGAGCAGGACCCACAGTTTTTGGCTTTGGCT TCTCCTAAGACTTTGATATCTAGATATTAA

以含有合成基因的質粒PUC57-AeAT9、PUC57-VAAT為模板，分別用引物AeAT9-U/AeAT9-D、VAAT-U/VAAT-D進行PCR擴增，得到AeAT9基因和VAAT基因。采用限制性核酸內切酶XhoI對質粒Yep352-PGK進行酶切，將線性化質粒Yep352-PGK切膠純化回收后，采用ClonExpressTMⅡ重組克隆試劑盒將其分別與AeAT9基因、VAAT基因進行體外重組，得到重組質粒Yep352-PGK（AeAT9）和Yep352-PGK（VAAT）。

圖1 重組質粒Yep352-PGK(AeAT9)（A）和Yep352-PGK(VAAT)（B）的構建Fig. 1 Construction of recombinant plasmids Yep352-PGK(AeAT9)(A) and Yep352-PGK(VAAT) (B)

（3）過表達AeAT9、VAAT基因重組菌株的構建

以釀酒酵母AY12-α的基因組為模板，分別使用引物GA-U/GA-D和GB-U/GB-D PCR擴增得到Gal80基因上游同源臂GA基因片段以及下游同源臂GB基因片段；以質粒pUG6作為模板，使用引物Kr-U/Kr-D PCR擴增得到loxp-KanMX-loxp基因片段；分別以質粒Yep352-PGK（AeAT9）和Yep352-PGK（VAAT）作為模板，使用引物PP-U/PP-D PCR擴增得到PGK1P-AeAT9-PGK1T基因片段及PGK1P-VAATPGK1T基因片段。將PCR擴增得到的基因片段GA、PGK1PAeAT9-PGK1T、loxp-KanMX-loxp和GB及GA、PGK1P-VAATPGK1T、loxp-KanMX-loxp和GB純化回收后，采用醋酸鋰轉化法[23]分別導入釀酒酵母AY12-α中，經過胞內同源重組后獲得釀酒酵母單倍體重組菌株α-AeAT9和α-VAAT。同源重組過程見圖2。

圖2 轉化片段的同源重組過程Fig. 2 Homologous recombination process of converted fragments

轉化后的菌液經修復培養后，適當稀釋涂布于含有300 μg/mL G418抗性的YEPD培養基，30 ℃條件下培養2～3 d，挑取轉化子擴培后，提取基因組進行PCR擴增驗證。

（4）轉化子篩選標記的去除

用醋酸鋰化學轉化的方法將帶有Cre重組酶的pGAPza質粒導入重組菌株獲得轉化子；挑取轉化子的單菌落于半乳糖培養基中誘導12 h，稀釋涂布于YEPD培養基，30 ℃培養2 d。將長出的單菌落在YEPD培養基和含300 μg/mL G418抗性的YEPD培養基上進行影印點板，挑出在YEPD培養基上生長而在G418抗性培養基上不生長的菌株，提取其基因組進行PCR擴增驗證。若以該基因組為模板擴增KanMX片段，無法得到1 600 bp左右的條帶，而以轉化前的重組菌株的基因組為模板則能擴增得到該基因片段，證明菌株成功去除KanMX篩選標記。

1.3.2 生長曲線的測定

分別從斜面上挑取一環菌株AY12-α、α-AeAT9和α-VAAT接種于5 mL YEPD液體培養基中，30 ℃、180 r/min培養12 h，混勻，分別取10 μL、12 μL、14 μL和16 μL菌液依次加入含有390μL、388μL、386μL和384μLYEPD液體培養基的100孔板的孔中，取400 μL YEPD液體培養基做空白對照。將100孔板放置于全自動生長曲線測定儀中，30 ℃培養，每隔1 h測定波長600 nm處的吸光度值（OD600nm值）。以培養時間（X）為橫坐標，OD600nm值（Y）為縱坐標，繪制生長曲線。

1.3.3 白酒液態模擬發酵[21]

以親本菌株AY12-α作為對照，取一環保藏在固體斜面上的待發酵菌株α-AeAT9、α-VAAT接種于裝有5 mL一級發酵種子培養基的試管中，30 ℃條件下靜置培養24 h。將一級培養物全部轉入45 mL二級發酵種子培養基中，30 ℃靜置培養16～17 h。測定菌液OD600nm值，取相應體積換算成相同菌體數量（1.8×109CFU/mL）接種到135 mL發酵培養基中，在30 ℃培養箱中靜置發酵。發酵期間，每隔12 h稱一次質量，稱質量前充分搖晃三角瓶，盡量將瓶中的CO2排凈，當兩次失質量＜1 g，表明發酵結束。發酵結束后對各菌株的CO2失質量、酒精度、還原糖、高級醇和酯類物質的產量進行測定。

1.3.4 測定方法

CO2失質量、酒精度、還原糖含量的測定：按照參考文獻[24]的方法進行。

乙酸含量的測定[21]：將發酵液進行10倍稀釋，經0.22 μm的濾膜過濾后，采用高效液相色譜儀測定。HPLC條件：Aminex HPX-87H色譜柱（300 mm×7.8 mm×9 μm），柱溫為60 ℃，進樣量為10 μL，流動相為5 mmol/L的稀硫酸，流速為0.6 mL/min，檢測器為示差折光檢測器。

高級醇和酯類含量的測定[25]：將100 mL發酵液和100 mL水混勻后進行蒸餾，蒸餾出100 mL的酒樣。將酒樣經0.22 μm的濾膜過濾后，采用氣相色譜儀測定。GC條件：Agilent1909N-213（30 m×0.32 mm×0.5 μm）毛細血管色譜柱，檢測器為氫火焰離子化檢測器（flame ionization detector，FID），進樣口溫度為200 ℃，檢測器溫度為200 ℃，進樣量為1 μL，分流比為10∶1，載氣為高純度的氮氣（N2），流速為2.0 mL/min，程序升溫（起始柱溫50 ℃，保持8 min，再以5 ℃/min的升溫速度上升至120 ℃，保持5 min）。

2 結果與分析

2.1 重組質粒Yep352-PGK（AeAT9）和Yep352-PGK（VAAT）的構建

為了以強啟動子PGK1p對來自獼猴桃和草莓的醇酰基轉移酶基因AeAT9、VAAT進行過表達，構建重組質粒Yep352-PGK（AeAT9）和質粒Yep352-PGK（VAAT），采用PCR擴增進行驗證，PCR擴增產物經0.8%瓊脂糖凝膠電泳，結果見圖3。

圖3 重組質粒Yep352-PGK(AeAT9)和Yep352-PGK(VAAT)的PCR驗證結果Fig. 3 PCR verification results of recombiant plasmids Yep352-PGK(AeAT9) and Yep352-PGK(VAAT)

由圖3可知，以重組質粒Yep352-PGK（AeAT9）為模板PCR擴增得到堿基長度為1 299 bp的AeAT9基因片段和堿基長度為3 036 bp的PGK1P-AeAT9-PGK1T基因片段，以重組質粒Yep352-PGK（VAAT）為模板PCR擴增得到堿基長度為1 368 bp的VAAT基因片段和堿基長度為3 105 bp的PGK1P-VAAT-PGK1T基因片段。PCR驗證結果與理論預期一致，表明PGK1P-AeAT9-PGK1T基因片段和PGK1P-VAATPGK1T基因片段成功插入Yep352-PGK質粒的多克隆位點處，重組質粒Yep352-PGK（AeAT9）和Yep352-PGK（VAAT）構建成功。

2.2 過表達醇酰基轉移酶基因AeAT9、VAAT重組菌株的構建

2.2.1 過表達AeAT9、VAAT基因轉化子的獲得

采用引物D1-U/DA-D、DA-U/D2-D、D3-U/D3-D和D1-U/DV-D、DV-U/D2-D、D3-U/D3-D分別對重組菌株α-AeAT9和α-VAAT進行上、中、下游定點PCR驗證，PCR擴增產物經0.8%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，結果見圖4。

圖4 重組菌株α-AeAT9和α-VAAT的PCR驗證結果Fig. 4 PCR verification results of recombinant strains α-AeAT9 and α-VAAT

由圖4可知，分別以提取的α-AeAT9和α-VAAT轉化子基因組為模板進行PCR擴增，采用上游引物D1-U/DA-D、D1-U/DV-D PCR擴增得到的產物堿基長度均在3 700 bp左右；采用中游引物DA-U/D2-D、DV-U/D2-D PCR擴增得到的產物堿基長度均在3 200 bp左右；采用下游引物D3-U/D3-D PCR擴增得到的產物堿基長度均在2 700 bp左右；上述條帶大小均與理論預期一致，且出發菌株AY12-α的陰性對照均無條帶。說明重組盒GA-PGK1P-AeAT9-PGK1T-loxp-KanMXloxp-GB、GA-PGK1P-VAAT-PGK1T-loxp-KanMX-loxp-GB已分別成功導入到釀酒酵母AY12-α基因組中，并且重組位置正確，獲得了正確的α-AeAT9和α-VAAT轉化子。

2.2.2 轉化子篩選標記KanMX的去除

通過1.3.1的方法去除α-AeAT9和α-VAAT轉化子的篩選標記KanMX，分別以其基因組為模板進行PCR擴增驗證，PCR擴增產物經0.8%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，結果見圖5。

圖5 重組菌株去除KanMX篩選標記PCR驗證Fig. 5 Verification of screening marker KanMX removal of recombinant strains by PCR

由圖5可知，以轉化pGAPza質粒前后的重組菌株基因組為模板，通過引物Kr-U/Kr-D獲得PCR擴增產物，前者作為陽性對照均有1 600 bp左右的特異性條帶，后者均無條帶，該結果與理論預期相符，證明菌株α-AeAT9和α-VAAT成功去除KanMX篩選標記。

2.3 重組菌株的生長性能

親本菌株AY12-α和重組菌株α-AeAT9、α-VAAT的生長曲線見圖6。

圖6 親本菌株AY12-α和重組菌株α-AeAT9、α-VAAT生長性能的比較Fig. 6 Comparison of growth characteristics of parent strain AY12-α and recombiant strains α-AeAT9 and α-VAAT

由圖6可知，重組菌株α-AeAT9、α-VAAT的生長速率與出發菌株AY12-α保持一致，而且最終達到的最大生物量基本一致，說明AeAT9、VAAT基因的過表達對菌株的生長基本無影響。

2.4 重組菌株的基本發酵性能

以親本菌株AY12-α作為對照組，對重組菌株α-AeAT9、α-VAAT進行白酒液態模擬發酵，整個發酵周期為4 d。發酵結束后對各菌株的基本發酵性能進行測定，結果見表3。

表3 親本菌株AY12-α和重組菌株α-AeAT9、α-VAAT發酵性能的比較Table 3 Comparison of fermentation characteristics of parent strain AY12-α and recombinant strains α-AeAT9 and α-VAAT

由表3可知，重組菌株α-AeAT9、α-VAAT和出發菌株AY12-α在相同條件下發酵結束后，CO2總質量損失、還原糖含量和酒精度無顯著變化（P＞0.05），表明本實驗中的基因敲除和過表達的操作不會對菌株基本發酵性能產生不利影響。從乙酸的產量變化來看，重組菌株與親本菌株相比，乙酸的積累量顯著降低（P＜0.05）。該結果表明醇酰基轉移酶AeAT9、VAAT催化乙醇和乙酰輔酶A反應生成乙酸乙酯，致使更多的乙酸通過乙酰輔酶A合成酶轉化為乙酰輔酶A，從而使得乙酸減少；同時，重組菌株α-AeAT9的乙酸積累量顯著低于重組菌株α-VAAT（P＜0.05），表明醇酰基轉移酶AeAT9對于合成乙酸乙酯的催化效率高于VAAT。

表4 親本菌株AY12-α和重組菌株α-AeAT9、α-VAAT高級醇及酯生成量的比較Table 4 Comparison of higher alcohols and esters content between parent strainAY12-α and recombinant strains α-AeAT9 and α-VAAT mg/L

2.5 重組菌株的醇酯生成量

重組菌株α-AeAT9、α-VAAT的高級醇和酯產量見表4。

由表4可知，重組菌株α-AeAT9和α-VAAT的乙酸乙酯生成量分別為（792.26±10.04）mg/L和（204.19±5.83）mg/L，分別為出發菌株AY12-α的55.40倍和14.28倍。結果表明醇酰基轉移酶AeAT9、VAAT對于乙酸乙酯的合成有顯著促進作用（P＜0.05），且醇酰基轉移酶AeAT9的作用效果顯著優于VAAT（P＜0.05）。另外重組菌株的乙酸異戊酯的生成量較出發菌株變化趨勢與乙酸乙酯一致。值得注意的是，重組菌株的主要高級醇（異丁醇、異戊醇、正丙醇、苯乙醇）總含量分別為（152.77±2.14）mg/L和（190.04±2.63）mg/L，較出發菌株降低了37.10%和21.75%，其中異戊醇的生成量變化最為明顯，可能是由于醇酰基轉移酶AeAT9、VAAT催化異戊醇和乙酰輔酶A縮合形成乙酸異戊酯的結果[18-20]。

3 結論

在釀酒酵母菌株AY12-α中，分別引入來自綠色植物獼猴桃和草莓的醇酰基轉移酶基因AeAT9、VAAT，成功構建了重組菌株α-AeAT9、α-VAAT。重組菌株α-AeAT9、α-VAAT的乙酸乙酯生成量分別為（792.26±10.04）mg/L和（204.19±5.83）mg/L，分別為親本菌株的55.40倍和14.28倍；主要高級醇總含量分別為（152.77±2.14）mg/L和（190.04±2.63）mg/L，較親本菌株分別降低37.10%和21.75%。本實驗為提高釀酒酵母酯類合成及降低高級醇的研究提供了思路和參考；同時該研究所獲得的高產乙酸乙酯的重組菌株在白酒生產中有一定的應用潛力，有利于提高白酒的風味和質量。