常壓室溫等離子誘變與微生物微滴培養選育幾丁質脫乙酰基酶高產菌株

馬欽元，申雁冰，丁盼盼，屠琳娜，畢心宇，王 敏*

（1.天津科技大學 生物工程學院 工業發酵微生物教育部重點實驗室，天津300457；2.洛陽華清天木生物科技有限公司，河南 洛陽471023）

幾丁質是自然界中僅次于纖維素的第二大生物聚合物，主要存在于無脊椎動物，如蝦、蟹、昆蟲、海藻以及真菌及酵母細胞壁中[1-2]。盡管幾丁質含量豐富，但由于其不溶解特性導致商業應用價值較低。殼聚糖是幾丁質脫掉乙酰基的產物，因其可溶于稀酸，商業應用價值較幾丁質有大幅度提升，被廣泛應用于生物醫藥、食品生產、農業、水處理等領域[3-4]。目前殼聚糖主要采用傳統化學法生產，存在環境污染嚴重、工藝難控制、產品質量特別是脫乙酰度不穩定等問題[5-7]。采用幾丁質脫乙酰基酶（chitin deacetylase，CDA）酶法脫乙酰制備殼聚糖，因其反應過程易于控制、產品脫乙酰度穩定、環境污染小等優點，成為殼聚糖生產的替代選擇，并越來越受到人們的重視。然而，由于CDA產率低、底物不溶解等問題[8]，目前該工藝還無法實現產業化應用[9]，所以高產CDA的菌株篩選仍然是解決CDA應用的主要途徑之一。

常壓室溫等離子體（atmospheric and room temperature plasma，ARTP）誘變技術是一種高效的微生物育種技術[10-11]。微生物微滴培養（microbial microdroplet-culture，MMC）技術是基于液滴微流控技術最新研發而成的一款微生物培養系統，是一種基于微流控技術的微型化、自動化、智能化的高通量微生物培養，具有高通量、自動傳代、化學因子梯度添加、在線檢測液滴光譜、微生物分選等功能[12]。ARTP目前已經高效應用于多種細菌、真菌以及植物種子等的誘變選育[13-19]，但鮮有將ARTP應用于CDA發酵菌株的誘變選育，同時MMC也是首次被應用于CDA高產菌株的高通量篩選。

為了獲得高效獲得CDA的高產菌株，該研究以可分泌作用大分子底物CDA的馬紅球菌（Rhodococcus equiCGMCC14861）為出發菌株[20]，首先進行室溫等離子（ARTP）誘變，并通過微滴培養（MMC）技術進行了誘變高產菌株的高通量液滴篩選，隨后將篩選到的液滴進行了進一步的稀釋平板篩選和24深孔板復篩，并通過對比分析單位菌體產CDA的能力確定最佳誘變高產菌株。該研究提供了一種新的CDA高通量篩選方法，為CDA高產菌株的誘變選育以及其他可通過顯色反應進行菌株篩選的工作提供了借鑒。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌株

馬紅球菌（Rhodococcus equi）：天津科技大學生物工程學院分離、鑒定，保藏于中國普通微生物菌種保藏管理中心（China general microbiological culture collection center，CGMCC）（保藏號：CGMCC14861）。

1.1.2 試劑

蛋白胨、酵母膏（均為生化試劑）：北京奧博星生物技術有限責任公司；氯化鈉（分析純）：天津時北方天醫化學試劑廠；4-硝基乙酰苯胺（分析純）：上海廣銳生物科技有限公司；瓊脂粉（生化試劑）：北京化學試劑公司。

1.1.3 培養基

LB液體培養基：蛋白胨10 g/L，酵母浸粉5 g/L，氯化鈉10 g/L，pH6.0～7.0。

LB固體培養基：在LB液體培養基中加入瓊脂粉20 g/L。

篩選培養基：在LB培養基中加入50 mg/L的4-硝基乙酰苯胺。

上述培養基均121 ℃高壓蒸汽滅菌30 min。

1.2 儀器與設備

ⅡS型ARTP誘變育種儀：江蘇無錫源清天木生物科技有限公司；MMC-1全自動高通量微生物微滴培養儀：洛陽華清天木生物科技有限公司；ELX808全自動酶標儀：美國Biotek公司；ZHWY-211F 往復式大容量恒溫搖床：上海智誠分析儀器制造有限公司；UVmini-1240紫外可見分光光度計：日本島津公司；ZXSD-B1160電熱恒溫培養箱：上海智城分析儀器制造有限公司；GI54D立式壓力蒸汽滅菌鍋：美國Zealway公司。

1.3 方法

1.3.1 菌株種子液及發酵液的制備

種子及發酵培養液的制備：將分離純化得到的馬紅球菌（Rhodococcus equi）CGMCC14861轉接至裝液量為50 mL/250 mL的LB液體培養基中，于37 ℃、200 r/min條件下培養24 h，得到種子液。按照接種量為10%將種子液接種于裝液量為50 mL/250 mL的LB液體培養基中，于37 ℃、200 r/min條件下發酵培養48 h，得到發酵液。

1.3.2 CDA原始菌株的ARTP誘變[18-19]

取1 mL培養24 h的馬紅球菌（R.equi）CGMCC14861菌液于6 000 r/min離心3 min，棄上清液，生理鹽水洗滌2次，再將菌體重懸于1 mL生理鹽水制成菌懸液。調節均懸液OD600nm值在0.6～0.8，然后吸取10 μL涂在誘變鋅片（鋅片先用酒精燈燒熱，在超凈臺冷卻后用移液器涂片），然后進行ARTP誘變，為確定最佳處理時間，分別設置菌懸液的誘變時間為10 s、20 s、30 s、40 s、50 s、60 s、70 s、80 s，誘變完成后將鋅片放入裝有1 mL無菌水的EP管，稀釋10 000倍后進行平板涂布，平板37 ℃培養24 h進行致死率曲線的繪制。選取致死率70%～80%的誘變時間進行4輪誘變。

1.3.3 誘變高產CDA菌株的篩選

設計了包括ARTP誘變、微滴培養（MMC）、LB平板初篩和24深孔板發酵復篩四部分內容的高產幾丁質脫乙酰基酶菌株的誘變選育方法，見圖1。以R.equiCGMCC14861為出發菌株首先進行ARTP誘變，誘變后，將誘變后的菌懸液加入含有4-硝基乙酰苯胺（50 mg/L）的LB液體培養基中進行微滴培養（MMC）。單個微流控芯片包含0～200個液滴單元，其中每個液滴的體積約為2 μL，液體可以進行350～800 nm的波長掃描，選擇400 nm作為篩選波長。篩選到吸光度值較對照組明顯升高的液滴，然后將液滴進行稀釋后涂布于加入含有4-硝基乙酰苯胺（50 mg/L）的LB固體培養基中進行初篩，固體培養基中的4-硝基乙酰苯胺可以被菌體產生的幾丁質脫乙酰基酶脫乙酰生成黃色的4-硝基苯胺而產生黃色圈，黃色圈越大說明菌體的產酶能力越強，所以選擇黃色圈較大的菌落進行24深孔板37 ℃發酵培養4 h進行復篩驗證。

圖1 常壓室溫等離子+微流控對高產ReCDA菌株的誘變選育流程Fig. 1 Process of mutagenesis and breeding of high-yield ReCDA strain by atmospheric and room temperature plasma and microbial microdroplet-culture

1.3.4 CDA酶活力檢測[20]

采用4-硝基乙酰苯胺脫乙酰生成對硝基苯胺產物的顏色變化在波長400 nm下發生明顯的吸光度值變化來表征酶活力。

（1）對硝基苯胺標準曲線的制作

準確稱取0.005 g對硝基苯胺，加少量水溶解并在50 mL容量瓶中定容。然后用去離子水進行10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7、10-8、10-9梯度稀釋，以去離子水為參照，測定波長400 nm處的吸光度值。以對硝基苯胺質量濃度（x）為橫坐標，吸光度值（y）為縱坐標，繪制對硝基苯胺標準曲線。

（2）反應體系

稱取10 mg 4-硝基乙酰苯胺，用50 mL容量瓶定容，質量濃度為200 mg/L。加200 mg/L的4-硝基乙酰苯胺0.3 mL，再加酶液0.3 mL（直接吸取發酵液），37 ℃預保溫的磷酸鹽緩沖液（0.05 mol/L，pH=7）0.9 mL，在37 ℃水浴中反應1 h，沸水浴終止酶活反應。

（3）酶活檢測

終止反應后的溶液經10 000 r/min離心分離5 min，測定上清液波長400 nm處吸光度值，設置3個平行。空白對照：加4-硝基乙酰苯胺溶液0.3 mL，加緩沖液0.9 mL，0.3 mL滅活酶液（沸水浴滅活）。

（4）CDA酶活力定義及酶活力計算

CDA酶活力定義：在上述反應條件下，每小時產生1微克對硝基苯胺所需要的酶量定義為一個酶活力單位（U/mL）。

CDA酶活力計算公式如下：

式中：A400nm為酶解液樣品的吸光度值；A0為空白的吸光度值；D為稀釋倍數；T為酶促反應時間，h；K為線性系數。

2 結果與分析

2.1 ARTP誘變致死率曲線

ARTP不同處理時間對R.equiCGMCC14861的生長及致死率影響，結果見圖2。由圖2a可知，ARTP照射處理10 s、20 s、30 s、40 s、50 s、60 s、70 s、80 s后，R.equiCGMCC14861的生長明顯受到抑制。由圖2b可知，ARTP照射處理10 s、20 s、30 s、40 s、50 s、60 s、70 s、80 s后，致死率分別為25.5%、62.8%、80.40%、96.87%、98.10%、99.14%、99.39%、99.88%。根據研究報道，選取致死率為70%～80%時，誘變效果最佳[20]。根據實驗結果，誘變時間20s時致死率為62.8%、30 s時達到了80.40%，誘變時間25s的致死率可在70%～80%這個范圍，因此，本研究采用ARTP誘變時間為25 s。

圖2 常壓室溫等離子不同誘變時間對馬紅球菌CGMCC14861生長（a）及致死率（b）的影響Fig. 2 Effect of different atmospheric and room temperature plasma treatment times on the growth (a) and mortality rates (b) of Rhodococcus equi CGMCC14861

2.3 誘變高產菌株的MMC篩選

ARTP誘變后的菌液加入MMC培養系統進行高產CDA液滴的篩選，結果見圖3。

由圖3可知，經過ARTP誘變后有多個液滴的OD400nm值數據隨著發酵時間的延長增加顯著。其中，有五個液滴的OD400nm值數據增幅最大，分別是液滴73、74、75、76和105，表明這5個液滴中CDA的活性較高。所以，推測這五個液滴中均存在高產CDA的誘變菌株。五個液滴中73、74、75、76四個液滴相鄰且均出現OD400nm值數據增幅較大的結果，說明在這個范圍的液滴中可能存在相同的高產CDA誘變菌株。

圖3 馬紅球菌CGMCC14861的微生物微滴培養結果Fig. 3 Results of microbial microdroplet-culture of Rhodococcus equi CGMCC14861

2.4 誘變高產菌株的復篩

對獲得的五個OD400nm值數據增幅最大的液滴分別稀釋后進行LB平板初篩及24深孔板復篩，平板初篩主要是通過固體培養基中的4-硝基乙酰苯胺可以被菌體產生的幾丁質脫乙酰基酶脫乙酰生成黃色的4-硝基苯胺而產生黃色圈，黃色圈越大說明菌體的產酶能力越強，選擇黃色圈較大的菌落進行24深孔板37 ℃發酵培養4 h進行復篩驗證，復篩的原理主要是模擬微量液體發酵，發酵4h后取樣檢測酶活確定高產CDA的菌株，結果見圖4。由圖4a可知，原始菌株R.equiCGMCC14861在24深孔板發酵4 h的OD400nm值為0.207，紅線以上為產酶增加的菌株，其中OD400nm值＞0.630的有17株（A41、B4、B5、B7、B14、B24、B39、C7、C26、C35、C41、C53、C59、C63）。即經過多輪篩選最終從700多個平板單菌落中篩選出17株與原始菌株相比發酵產酶提高300%以上的誘變高產CDA菌株。由圖4b可知，表征誘變菌株CDA產量的OD400nm值與表征菌體生長的OD600nm值并不成正比，說明誘變菌株的CDA產量提升并不完全是由菌體量的增加導致。

圖4 幾丁質脫乙酰基酶高產菌株平板初篩（a）及24深孔板復篩（b）結果Fig. 4 Results of plate preliminary screening (a) and 24-deep-hole plate rescreening(b)of strains with high chitin deacetylase yield

篩選到的17株高產CDA菌株，其產酶及菌體生長變化結果見表1。由表1可知，OD600nm值最高的3個菌株分別是A41、C22和C39，產酶OD400nm值最高的三個菌株分別是B4、C7和C63，由此可見，誘變后菌株的CDA產量變化跟菌體生長并不成正比。為了更加準確的表征誘變菌株的產CDA能力，對比分析了菌株OD400nm值/OD600nm值（OD400nm值/OD600nm值表示單位菌體的CDA產量），由表1可以看出，OD400nm值/OD600nm值數值最高的3個菌株分別是B4、C26和C41，即該3株菌株單位菌體產CDA最高（因為OD400nm值是表征菌體產酶水平的，OD600nm值是表征菌體量的，兩個數據的比值可以表征單位菌體的產酶量），其中菌株B4 OD400nm值/OD600nm值最高，為出發菌株的3.15倍。

表1 幾丁質脫乙酰基酶菌株的產酶及菌體生長對比Table 1 Comparison of chitin deacetylase production and growth of strains

選取菌株B4進行搖瓶培養發酵實驗，發酵產酶曲線見圖5。由圖5可知，發酵36 h誘變菌株B4達到最大產酶419.11 U/mL，是空白對照107.58 U/mL的3.90倍。經過進一步的穩定性實驗，確定最佳幾丁質脫乙酰基酶高產菌株為B4。

圖5 菌株B4搖瓶培養產幾丁質脫乙酰基酶曲線Fig. 5 Chitin deacetylase production curve of strain B4 with shake flask culture method

3 結論

本研究構建了基于常壓室溫等離子體（ARTP）誘變技術與微液滴流控篩選（MMC）技術的幾丁質脫乙酰基酶（CDA）高產菌株的誘變選育方法，誘變照射時間為25 s時致死率達到70%～80%，經過多輪的誘變選育，最后獲得了17株產酶提高300%以上的CDA誘變高產菌株，通過對比分析17株高產菌株單位菌體產CDA的能力及發酵驗證，獲得了1株單位菌體產酶提升3.15倍的CDA高產菌株B4，發酵產酶總量達到419.11 U/mL，為原始菌種的3.90倍。本研究為CDA高產菌株的誘變選育及高通量篩選提供了一種新的方法和借鑒。

采用的誘變選育和構建的快速篩選方法對于篩選CDA高產菌株是有效和可行的。但該方法能夠得到有效應用的前提是找到了CDA脫乙酰后發生顏色反應的底物4-硝基乙酰苯胺，且該底物對于菌株的生長和發酵未發生明顯的抑制作用。該方法目前還不適用于無法直接通過發酵液的吸光值變化來表征菌株變化的情況。