ISSR標記技術輔助形態學的紅曲菌株分類鑒定

朱麗萍，陳福生，楊 強，陳申習，邵彥春*

（1.華中農業大學 食品科學技術學院，湖北 武漢430070；2.勁牌有限公司勁牌研究院 中藥保健食品質量與安全湖北省重點實驗室，湖北 大冶435100）

紅曲菌（Monascusspp.）又稱為紅曲霉，是我國重要的藥食同源微生物。其發酵產品——紅曲在我國有近兩千年的應用歷史[1]。在分類地位上，將紅曲菌歸屬于散囊菌目（Eurotiales）、曲霉科（Aspergillaceae）、紅曲霉屬（Monascus）[2]。目前，關于紅曲菌種的分類，一直存在著爭議，文獻報道的紅曲菌有30余種：1983年，HAWSKWORTH D L等[3]將紅曲菌歸分為3類；1987年，BARNARD E L等[4]研究發現，弗羅里達紅曲菌（Monascus floridanus）新種；1995年，CANNON P F等[5]發現2個新種：依據有性世代形態將其命名為蒼白紅曲菌（Monascus pallens）和血紅紅曲菌（Monascus sanguineus）；2007年，李鐘慶等[6]利用形態學方法對紅曲菌屬進行分類后重新確認為8個種；2017年，BARBOSA R N等[7]將紅曲菌種分為兩組共9種，第一組為弗羅里達（Floridani）組，包括黃色紅曲菌（Monascus flavipigmentosum）、蜂蜜紅曲菌（Monascus mellicola）、累西腓紅曲菌（Monascus recifensis）、弗羅里達紅曲菌（Monascusfloridanus）、蒼白紅曲菌（Monascus pallens）、新月紅曲菌（Monascus lunisporas）和阿根廷紅曲菌（Monascus argentinensis）7個種；第二組為紅色（Rubri）組，包括紅色紅曲菌（Monascus ruber）和紫色紅曲菌（Monascus purpureus）2個種，并認為叢毛紅曲菌（Monascus pilosus）與紅色紅曲菌（Monascus ruber）為同一物種，血紅紅曲菌（Monascus sanguineus）與紫色紅曲菌（Monascus purpureus）為同一物種；2018年，何亞濤[8]將紅曲菌分為兩個組共10種，第一組為弗羅里達（Floridani）組，與BARBOSA R N等[7]報道一致；第二組為紅色（Rubri）組包括紅色紅曲菌（Monascus ruber）、紫色紅曲菌（Monascus purpureus）和血紅紅曲菌（Monascussanguineus）3個種，其中認為血紅紅曲菌（Monascus sanguineus）為一個獨立的種。表明紅曲菌物種具有豐富的多樣性，有必要借助有效的分類方法進行區分。

目前，紅曲菌的分類鑒定方法主要包括傳統的形態學方法和現代的分子生物學方法[9]。依據形態特征進行分類的方法是紅曲菌分類鑒定的主要手段[10]，但由于受環境、人的主觀判斷的影響較大，往往不能有效區分形態相近的種。而物種的脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）序列信息通常不受外界環境的影響，因此，基于DNA序列信息的分子標記技術常被用來輔助形態學分類[11]。分子生物學方法共同的特點是以DNA為材料，通過聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）擴增，依據瓊脂糖凝膠電泳檢測結果或DNA測序結果進行聚類分析，但由于各種分子生物學技術的原理不同，并且PCR擴增結果受擴增體系內組分、擴增條件等因素的影響較大，不同分子生物學分類方法可能會出現聚類結果不一致的情況。通過比較分析不同的分子標記技術，內部簡單重復序列（inter simple sequence repeats，ISSR）技術被篩選出來作為輔助紅曲菌形態學分類的有效方法[12-13]。

ISSR標記技術是利用真核生物基因組中廣泛存在的簡單重復序列（simple sequence repea，SSR），設計出能與其結合的各種PCR引物，對兩個相距較近且方向相反的SSR序列之間的DNA區段進行擴增，并檢測其多態性[14]。ISSR技術所用的PCR引物長度在20個核苷酸左右，可以采用與常規PCR相同的反應條件，具有操作簡單、可重復性高、模板DNA用量少等優點[15-16]，且ISSR指紋分析可以作為區分具有相似形態或ITS序列的絲狀真菌[17]，以及分析檢測種的復雜度和驗證新種的有效工具。因此，本研究利用形態學分類鑒定法結合ISSR分子生物學分類鑒定法鑒別25種不同來源的紅曲菌，以期為不確定歸屬種的紅曲菌株分類鑒定提供一種輔助鑒定手段。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌株

25株實驗用菌株為MY1、MY2、MY3、ZH1、ZH2、ZH3、ZH4、ZH5、JC1、JC2、MG1、MG2、MG3、MF2、MF3、MS1、MS3、GW1、GW2、GW3、GW4、GW5、GW6、GW7、MS2，其中，前17株菌株分離自不同類型的紅曲產品，菌株MS1前期已被鑒定為叢毛紅曲菌（Monascus pilosus）保藏于中國典型培養物保藏中心，對應的編號為CCTCC M 2013295，其余16株保藏于華中農業大學食品科學與工程學院食品安全與技術實驗室；菌株GW1～GW7購自荷蘭菌種保藏中心，對應的編號分別為紅色紅曲菌（Monascus ruber）CBS 554.76、高梁紅曲菌（Monascus kaoliang）CBS 302.78、紫色紅曲菌（Monascus purpureus）CBS 736.83、血紅紅曲菌（Monascussanguineus）CBS 123568、紅色紅曲菌（Monascus ruber）CBS 254.65、叢毛紅曲菌（Monascus pilosus）CBS 290.34和紅色紅曲菌（Monascus ruber）CBS 291.34）；菌株MS2購自中國科學院微生物研究所菌種保藏中心，對應的編號為紫色紅曲菌（Monascus purpureus）AS 3.5838。

1.1.2 試劑

EasyTaqDNA聚合酶、Trans 2K plus Marker、Trans 15K Marker：北京全式金生物有限公司；RNase A：寶生物技術（北京）有限公司；麥芽汁浸粉、瓊脂（均為生化試劑）：安琪酵母股份有限公司；其他試劑均為國產分析純。

1.1.3 培養基[18]

馬鈴薯葡萄糖瓊脂（potato dextrose agar，PDA）培養基：200 g土豆去皮后切成小塊，加水煮沸20 min，過濾后，加入20 g葡萄糖，15 g瓊脂粉，以蒸餾水定容至1 000 mL，pH值自然。

麥芽提取物瓊脂（malt extract agar，MEA）培養基：麥芽提取粉20 g，蛋白胨1 g，葡萄糖20 g，瓊脂15 g，加蒸餾水定容至1 000 mL。

麥芽汁瓊脂（wort agar，WA）培養基：麥芽汁（15°Bx）1 000 mL，瓊脂15 g。

察氏酵母提取粉瓊脂（Czapek yeast extract agar，CYA）培養基：NaNO33.0 g，K2HPO41.0 g，KCl 0.5 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，FeSO4·7H2O 0.01 g，酵母提取物5.0 g，蔗糖20 g，瓊脂15 g，加蒸餾水定容至1 000 mL，pH值自然。

25%甘油硝酸鹽瓊脂（25%glycerol nitrate agar，G25N）培養基：在CYA培養基中加入25%甘油。

PDA培養基在115 ℃滅菌20 min。MEA、WA、CYA、G25N培養基在121 ℃滅菌20 min。

1.2 儀器與設備

T960型PCR儀：上海Heal Force公司；DYY-8C凝膠成像系統：北京六一電泳儀器廠；Neofuge 18R高速冷凍離心機：上海Heal Force公司；SCB-1360無菌操作臺：北京東聯哈爾儀器制造有限公司；HH-8水浴鍋：國華電器有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 紅曲菌的形態學觀察

菌落形態和顯微形態觀察：將在PDA上活化7 d后的25株菌株分別接種到MEA、WA、CYA、G25N培養基上，將平板倒置在25 ℃恒溫箱中培養，觀察第7天的菌落形態特征，主要記錄其菌落形態、生長速度、氣生菌絲疏密和產色素等情況；同時，取無菌蓋玻片，以傾斜約45°方式插入WA培養基中，每皿插入4～6片，25 ℃恒溫箱中倒置培養7 d，取蓋玻片在顯微鏡下觀察包括菌絲顏色及形態、分生孢子形態、閉囊殼和子囊孢子形態在內的顯微形態特征，記錄并拍照。

1.3.2 紅曲菌ISSR的聚類分析

紅曲菌基因組提取：具體提取步驟參照SHAO Y C等[19]的方法。

ISSR聚類分析：以25株供試紅曲菌的DNA為模板，采用前期篩選的包括808#、810#、811#、834#、835#、841#、842#在內的7條引物進行ISSR實驗，引物序列見表1[20]，根據擴增片段的多態性對供試菌株進行聚類分析。

表1 ISSR分析所用引物序列Table 1 Sequences of primers used in ISSR analysis

ISSR PCR擴增體系：模板1 μL，引物1 μL，脫氧核糖核苷三磷酸（deoxy-ribonucleoside triphosphate，dNTP）2 μL，10×buffer 2.5 μL，TaqDNA聚合酶0.3 μL，Mg2+（50 mmol/L）0.5 μL，雙蒸水（ddH2O）17.7 μL。PCR擴增程序：94 ℃預變性5 min；94 ℃變性30 s，52 ℃退火45 s，72 ℃延伸90 s，共40個循環；72 ℃再延伸7 min。PCR擴增結束后采用1%瓊脂糖凝膠電泳進行檢測。

DNA多樣性聚類分析：對照25株菌株PCR擴增產物的凝膠電泳圖，根據同一位點DNA條帶的有無編成1、0矩陣輸入計算機，用NTSYSpc軟件中的SIMQUAI程序計算菌株間的相似系數，最后采用UPGMA法進行聚類分析，構建相似聚類樹狀圖。相似系數的數值范圍為0～1，當數值接近于0時，表示兩菌株間遺傳相似性程度較低；當數值接近于1時，表示兩菌株間遺傳相似性程度較高。

2 結果與分析

2.1 供試紅曲菌形態學分類鑒定

2.1.1 供試紅曲菌的菌落形態觀察結果

參照《紅曲菌的形態與分類學》[18]，根據菌落形態分類描述，可將本研究的25株供試菌株分為6類，具體菌落形態描述見表2，其中6種典型紅曲菌的菌落形態見圖1。

表2 25株供試紅曲菌的菌落形態觀察結果Table 2 Results of colony morphology of 25 tested strains

圖1 6種典型菌株的菌落形態Fig. 1 Colony morphology of 6 typical strains

由表2及圖1可知，第一類為與叢毛紅曲菌（Monascus pilosus）MS1的菌落形態較為相似的菌株，包括菌株MS1、ZH3、GW6、MY1；第二類為與紫色紅曲菌（Monascus purpureus）GW3的菌落形態較為相似的菌株，包括菌株MG1、MG2、MG3、ZH4、ZH5、MF2、JC2、MS2、GW3；第三類為與紅色紅曲菌（Monascus ruber）GW1的菌落形態較為相似的菌株，包括菌株MY2、MY3、MS3、JC1、GW1、GW5、GW7；第四類為與高梁紅曲菌（Monascus kaoliang）GW2的菌落形態較為相似的菌株，包括菌株MF3和GW2；第五類為血紅紅曲菌（Monascus sanguineus）菌株GW4；菌株ZH1和ZH2菌落形態相近，但與其他菌株菌落形態均不相同，為第六類，需進一步分析鑒定。

2.1.2 紅曲菌顯微形態觀察結果

參照《紅曲菌的形態與分類學》[18]，根據WA培養基上顯微形態觀察結果，將25株供試菌株歸為7類，具體顯微形態觀察結果描述見表3，其中5種典型菌株的顯微形態見圖2。

由表3及圖2可知，第一類為與叢毛紅曲菌（Monascus pilosus）MS1的顯微形態較為相似的菌株，該類的分類結果與菌落形態分類結果相同；第二類為與紫色紅曲菌（Monascus purpureus）GW3的顯微形態較為相似的菌株，該類的分類結果與菌落形態分類結果減少了菌株MS2，同時增加了菌株ZH1和ZH2；第三類為與紅色紅曲菌（Monascusruber）GW1的菌落形態較為相似的菌株，該類的分類結果與菌落形態分類結果減少了菌株GW7；第四類為與高梁紅曲菌（Monascus kaoliang）GW2的菌落形態較為相似的菌株，該類的分類結果與菌落形態分類結果相同；第五類為血紅紅曲菌（Monascus sanguineus）菌株GW4，該類的分類結果與菌落形態分類結果相同；而菌株GW7和MS2的顯微形態中，分生孢子和菌絲形態不同，但均未觀察到其閉囊殼，可能由于這兩株菌株在WA培養基下很少產生或不產生閉囊殼，或其閉囊殼形成時間發生改變而未被觀察到。菌株GW7和MS2分別分類為第六類和第七類。

表3 25株供試紅曲菌顯微形態觀察結果Table 3 Results of microscopic morphology of 25 tested strains

圖2 5種典型菌株的顯微形態Fig. 2 Microscopic morphology of 5 typical strains

2.1.3 供試菌株的形態學鑒定結果

綜合形態觀察結果，根據《紅曲菌的形態與分類學》[18]，對25種供試菌株進行初步分類鑒定，結果見表4。

表4 25株供試菌株的形態學分類結果Table 4 Results of morphological classification of 25 tested strains

由表4可知，25株供試菌株歸為6類，分別為叢毛紅曲菌（Monascus pilosus）、紫色紅曲菌（Monascus purpureus）、紅色紅曲菌（Monascus ruber）、高梁紅曲菌（Monascus kaoliang）、血紅紅曲菌（Monascus sanguineus）和待定。其中菌株ZH1和ZH2菌落形態相近，而與其他菌種菌落形態顯著不同，僅見顯微形態與紫色紅曲菌的顯微形態相近，仍需進一步分析鑒定。菌株GW7和MS2的菌落形態分別與紅色紅曲菌和紫色紅曲菌相近，但顯微形態中未觀察到閉囊殼，有必要進一步分析鑒定。

2.2 供試紅曲菌ISSR分類結果

2.2.1 ISSR PCR擴增結果

25株供試紅曲菌的ISSR PCR擴增產物的瓊脂糖凝膠電泳結果見圖3，PCR擴增產物的總條帶數和多態性條數統計結果見表5。

由圖3及表5可知，每條引物可以擴增出7～16條DNA條帶，7條引物共擴增出88條DNA條帶，其中90.1%呈多態性，除血紅紅曲菌（Monascus sanguineus）GW4的ISSR擴增圖譜與其他菌株的圖譜差異較大，其余菌株均擴增出l～2條大小相同的條帶，這一方面表明了紅曲菌屬內種群之間遺傳背景的多樣性，另一方面也反映出它們同屬間的共性。

表5 ISSR PCR擴增產物的總條帶數和多態性條數Table 5 Total stripes and polymorphic stripes of PCR amplified products of ISSR

2.2.2 ISSR PCR擴增結果聚類分析

將每株紅曲菌用7條引物PCR擴增得到的所有條帶進行統計，結果見圖4。

圖4 基于ISSR 25株供試菌株聚類分析結果Fig. 4 Results of clustering analysis of 25 tested strains based on ISSR fingerprints

由圖4可知，供試紅曲菌菌株間的遺傳相似系數范圍為0.39～1.00，表現出一定的多態性。在相似性水平為0.9時，25株菌株可分為5類，第一類包括菌株ZH3、MY2、MS3、MS1、GW6、MY3、JC1、MY1、GW1、GW5在內的共10株菌株，這些菌株的遺傳相似系數＞0.91；第二類只有菌株GW7；第三類只有菌株GW4；第四類包括菌株MG3、ZH5、ZH1在內的共3株菌株，這些菌株的遺傳相似系數＞0.93；第五類包括菌株JC2、MG1、MF3、GW2、ZH4、MS2、MG2、GW3、MF2、ZH2在內的共10株菌株，這些菌株的遺傳相似系數＞0.93。

2.3 形態學分類結果與ISSR聚類結果比較分析

根據菌落形態，菌株GW7與紅色紅曲菌（Monascus ruber）相似，菌株MS2與紫色紅曲菌（Monascus purpureus）相似，但根據顯微形態，菌株GW7與MS2中均未觀察到閉囊殼。根據菌落形態，菌株ZH1、ZH2與其他菌株均不相同，而根據顯微形態，菌株ZH1、ZH2與紫色紅曲菌（Monascus purpureus）相似。為進一步分析這些菌株的分類關系，采用ISSR進行輔助分類分析。ISSR聚類分析結果顯示，菌株GW7與紅色紅曲菌（Monascus ruber）遺傳相似系數達到0.80，故將其鑒定為紅色紅曲菌（Monascus ruber）；菌株MS2與紫色紅曲菌（Monascus purpureus）遺傳相似系數達到1.00，則將其鑒定為紫色紅曲菌（Monascus purpureus）；菌株ZH1和ZH2與紫色紅曲菌（Monascus purpureus）遺傳相似系數分別為0.88和0.96，則將其均鑒定為紫色紅曲菌（Monascus purpureus）。

根據形態學分類方法，菌株MG3、ZH5的菌落形態和顯微形態，均與紫色紅曲菌（Monascus purpureus）相近，且根據聚類分析結果，菌株MG3、ZH5與紫色紅曲菌（Monascus purpureus）的遺傳相似系數＞0.88，所以將其均鑒定為紫色紅曲菌（Monascus purpureus）。

根據形態學分類方法，將菌株MF3、GW2歸為高梁紅曲菌（Monascus kaoliang）；而ISSR分子生物學分類結果顯示，菌株MF3、GW2與紫色紅曲菌（Monascus purpureus）的遺傳相似系數＞0.98，故將菌株MF3、GW2鑒定為紫色紅曲菌（Monascus purpureus）。此結果與李鐘慶等[6]報道的高梁紅曲菌（Monascus kaoliang）是紫色紅曲菌（Monascus purpureus）的同種異名結果一致。

根據形態學分類方法，將菌株ZH3、GW6、MY1、MS1鑒定為叢毛紅曲菌（Monascus pilosus）；菌株MY2、GW7、MY3、JC1、MS3、GW1、GW5鑒定為紅色紅曲菌（Monascus ruber），而叢毛紅曲菌（Monascuspilosus）MS1和紅色紅曲菌（Monascus ruber）GW1兩株標準菌株在MEA和WA培養基上菌落形態無明顯差異，且ISSR分子生物學分類結果顯示，菌株ZH3、MY3、MY2、叢毛紅曲菌（Monascus pilosus）GW6、MS3、叢毛紅曲菌（Monascus pilosus）MS1、MY1、JC1、GW5、紅色紅曲菌（Monascus ruber）GW1的遺傳相似系數＞0.91，故將菌 株ZH3、GW6、MY1、MS1、MY2、GW7、MY3、JC1、MS3、GW1、GW5綜合鑒定為紅色紅曲菌（Monascus ruber）。這與BARBOSA R N等[7]認為叢毛紅曲菌（Monascus pilosus）與紅色紅曲菌（Monascus ruber）為同一類的報道相符。

綜合形態學分類方法與ISSR分子鑒定的方法可知，目前市售紅曲產品的生產菌種主要為紅色紅曲菌（Monascus ruber）、紫色紅曲菌（Monascus purpureus），與文獻[21]報道的一致。但由于生產條件或菌株自身的遺傳差異，導致一些菌株分類鑒定存在不確定性。本研究表明，以形態學分類方法為基礎，以ISSR分子鑒定的方法為輔助，可以分析檢測紅曲菌種的復雜度以及相似性關系。研究結果也為了解市售紅曲相關發酵產品生產菌株的特征和應用情況，進一步發掘和保護紅曲菌株資源提供參考。

3 結論

本研究以市場購買的紅曲產品分離得到的17株紅曲菌和8株標準菌株為主要材料，根據其在MEA、WA、CYA、G25N四種培養基上的菌落形態和WA培養基上的顯微形態特征，將25株紅曲菌分為6大類，ISSR分子生物學分類鑒定法將25株紅曲菌分為5大類。綜合形態學與ISSR分子標記鑒定結果，25株紅曲菌株可以聚為3大類，將菌株ZH3、MY2、MS3、MS1、GW6、MY3、JC1、MY1、GW1、GW5、GW7鑒定為紅色紅曲菌（Monascus ruber）；將菌株MG3、ZH5、ZH1、JC2、MG1、MF3、GW2、ZH4、MS2、MG2、GW3、MF2、ZH2鑒定為紫色紅曲菌（Monascus purpureus）；菌株MG4鑒定為血紅紅曲菌（Monascus sanguineus）。