乳桿菌發(fā)酵葛根水提液工藝研究及其解酒功效探討

陳艷艷，于 波，潘黛安，陳靜靜，王思明，白雪媛

（長春中醫(yī)藥大學(xué) 吉林省人參科學(xué)研究院，吉林 長春130117）

葛根（Puerariae lobatae Radix）是多年生豆科植物野葛的干燥塊根，是國家衛(wèi)生部批準(zhǔn)的藥食兩用植物[1-2]。中藥葛根歷史悠久，最早記載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，后據(jù)《中國藥典》及《中華本草》等資料記載，葛根具有解酒的功效[3-4]，是古代文獻(xiàn)記載和現(xiàn)代研究證實(shí)解酒功效比較明確的中藥。葛根除富含淀粉、膳食纖維、17種氨基酸和大量礦質(zhì)元素外，主要活性成分為總黃酮中的異黃酮，研究證實(shí)葛根中含30多種異黃酮物質(zhì)，另含多糖、生物堿、三萜皂甙等功能活性成分，具有抑制脂質(zhì)過氧化，清除體內(nèi)自由基，抗氧化，預(yù)防心腦血管疾病，提高免疫力，降血糖，調(diào)節(jié)血脂，改善骨質(zhì)疏松，調(diào)節(jié)雌激素水平，調(diào)節(jié)血壓，益智和美容等藥理保健功能[5-9]。

大量研究證實(shí)，酒精進(jìn)入人體后的代謝是一系列氧化還原過程，乙醇代謝相關(guān)酶的作用至關(guān)重要，如超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、乙醇脫氫酶（alcohol dehydrogenase，ADH）、乙醛脫氫酶（acetaldehyde dehydrogenase，ALDH）及其亞型等，還原酶等增多可加快乙醇的氧化代謝速率，加速其還原成乙酸進(jìn)而排出體外[10-12]。

我國早在1 000多年前就已將微生物發(fā)酵的方法應(yīng)用于中藥炮制當(dāng)中，成為最早利用微生物轉(zhuǎn)化天然藥物的國家[13]，利用微生物發(fā)酵得到的中藥成分更易于吸收，而且能達(dá)到減毒增效的作用[14]。微生物發(fā)酵中藥能提高有效成分的含量，產(chǎn)生新化合物及減少不良反應(yīng)，促進(jìn)有效成分吸收和利用，是現(xiàn)代生物技術(shù)與中醫(yī)藥相結(jié)合的理想途徑[15-16]。CHOI Y等[17]研究發(fā)現(xiàn)，短雙歧桿菌發(fā)酵后的葛根在改善葡萄糖和脂代謝相關(guān)途徑方面更有效，發(fā)酵過程提高了乳酸含量，并促進(jìn)了某些微生物群落的富集，從而有助于抗肥胖和抗炎活動。

該研究用植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）和副干酪乳桿菌（Lactobacillus paracasei）混合發(fā)酵技術(shù)，考察發(fā)酵對葛根抗氧化成分及解酒功效的影響，為葛根成為更高效解酒食品提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

葛根飲片、56°牛欄山二鍋頭、力克保健液：市售；氫氧化鈉、硝酸鋁、亞硝酸鈉（均為分析純）；植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）：CGMCC 1.568、副干酪乳桿菌（Lactobacillus paracasei）CGMCC 1.2468：中國普通微生物菌種保藏管理中心。MRS肉湯培養(yǎng)基：北京索萊寶科技有限公司。天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（aspartate aminotransferase，AST）、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（alanine aminotransferase，ALT）試劑盒：南京建成生物工程研究所；超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）試劑盒：上海碧云天生物技術(shù)有限公司。

清潔級美國癌癥研究所（institule of cancer researcch，ICR）小鼠：雄性，體質(zhì)量（20±2）g，購自長春億斯實(shí)驗(yàn)動物技術(shù)有限公司。飼養(yǎng)環(huán)境溫度為（23±2）℃，相對濕度為40%～60%，明暗交替周期為12 h。

1.2 儀器與設(shè)備

SX-700蒸汽滅菌器：日本Tomy Digital Biology公司；SW-CJ-2D型雙人凈化工作臺：蘇州凈化設(shè)備有限公司；innova 40搖床：德國Eppendorf公司；UV-2550型紫外可見光度計(jì)：日本島津公司；KQ-600E型超聲清洗器：昆山超聲儀器有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 葛根提取液的制備

精密稱定葛根飲片，以1∶10（g∶mL）料液比加蒸餾水→沸騰后轉(zhuǎn)小火，1.5 h/次，煎煮兩次→3 500 r/min離心10 min后過絹布→濃縮至生藥質(zhì)量濃度為0.1 g/mL→分裝，高溫高壓滅菌鍋121 ℃滅菌60 min→晾涼至室溫，取一份4 ℃冷藏保存，設(shè)為葛根水提液對照組，其余備發(fā)酵。

1.3.2 乳酸菌發(fā)酵方法

采用兩步培養(yǎng)法培養(yǎng)，取甘油凍藏的植物乳桿菌和副干酪乳桿菌，4 ℃解凍，置紫外消毒30 min后的超凈臺中，取40 μL解凍菌液置于4 mL滅菌后的MRS培養(yǎng)基中，37 ℃，180 r/min培養(yǎng)24 h后得一級活化液，再取1 mL一級活化液置100 mL滅菌后的MRS培養(yǎng)基中，37 ℃、180 r/min培養(yǎng)24 h活化完成。按單因素試驗(yàn)及正交試驗(yàn)所需不同接種量，接種至滅菌后的葛根提取液中，搖床37 ℃，180 r/min條件下發(fā)酵試驗(yàn)所對應(yīng)不同時間[14]。

1.3.3 單因素試驗(yàn)

以初始pH值為6.0、接種量為3%、發(fā)酵時間為48 h、接種比例（植物乳桿菌∶副干酪乳桿菌=1∶1）為基礎(chǔ)條件，在固定其他因素條件下逐一進(jìn)行單因素試驗(yàn)，考察不同初始pH值（2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0），接種量（0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%、3.0%、3.5%、4.0%），發(fā)酵時間（6 h、12 h、18 h、24 h、30 h、36 h、42 h、48 h、54 h），植物乳桿菌與副干酪乳桿菌接種比例（1∶5、1∶2、1∶1、2∶1、5∶1）對SOD酶活性的影響。

1.3.4 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，以初始pH值（A）、接種量（B）、發(fā)酵時間（C）、植物乳桿菌∶副干酪乳桿菌接種比例（D）為試驗(yàn)因素，以SOD活性（R）為評價指標(biāo)，采用L9（34）正交設(shè)計(jì)試驗(yàn)，因素與水平見表1。

表1 發(fā)酵條件優(yōu)化正交試驗(yàn)因素與水平Table 1 Factors and levels of orthogonal experiments for fermentation conditions optimization

1.3.5 解酒防醉實(shí)驗(yàn)

取健康ICR雄性小鼠28只，適應(yīng)性飼養(yǎng)3 d后，隨機(jī)分為模型組、力克陽性對照組、葛根發(fā)酵液組、葛根水提液組，禁食不禁水12h后，各給藥組給予相應(yīng)藥物灌胃（0.15mL/10g），模型組給予生理鹽水0.15 mL/10 g。30 min后，各組小鼠灌胃給予56°牛欄山二鍋頭（0.15 mg/10 g），觀察小鼠醉酒潛伏期（灌酒到翻正反射消失時間）、醒酒時間（翻正反射消失到翻正反射恢復(fù)時間）[16]。

1.3.6 生物指標(biāo)檢測

（1）預(yù)處理

取健康ICR雄性小鼠35只，適應(yīng)性飼養(yǎng)3 d后，隨機(jī)分為陰性對照組、模型組、力克陽性對照組、葛根發(fā)酵液組、葛根水提液組，每天給予陰性對照組和模型組生理鹽水0.15 mL/10 g灌胃，其他組給予0.15 mL/10 g相應(yīng)藥物，30 min后，除陰性對照組灌胃生理鹽水外，其他組給予56°牛欄山二鍋頭0.08 mL/10 g，連續(xù)8 d。末次給藥30 min后，除陰性組外給予56°牛欄山二鍋頭0.1 mL/10 g。給酒后半小時摘眼球取血，脫椎處死，解剖取肝臟，用預(yù)冷生理鹽水漂洗后，用濾紙吸干水分，液氮冷凍備用[17-18]。

（2）血清AST、ALT檢測

摘眼球取血于離心試管中，3 000 r/min離心10 min，取上清，參照試劑盒方法測定血清中天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（AST）、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（ALT）含量。

（3）肝臟中SOD活力檢測

采用超氧化物歧化酶（SOD）試劑盒（WST-8）法，參照試劑盒說明書，準(zhǔn)確稱取組織質(zhì)量，按照質(zhì)量（g）∶體積（mL）=1∶9的比例加入9倍體積生理鹽水，剪碎組織，冰水浴制備勻漿，3 000 r/min，離心10 min，取上清即10%勻漿上清待測。通過預(yù)實(shí)驗(yàn)將10%組織勻漿上清用生理鹽水稀釋成適當(dāng)濃度后參照操作表操作后，37 ℃孵育20 min，于450 nm處測定各復(fù)孔吸光度值。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)

2.1.1 初始pH對SOD活力的影響

圖1 初始pH值對SOD活力的影響Fig. 1 Effect of initial pH value on SOD activity

由圖1可知，SOD活力隨初始pH的升高呈先升高再降低的趨勢，在pH為6.0時達(dá)到峰值。推測原因?yàn)榭赡苁牵跛嵝詶l件下乳酸菌的生長繁殖及次級代謝產(chǎn)物的產(chǎn)生較快，強(qiáng)酸以及偏堿性環(huán)境均不利于乳酸菌的生長繁殖及代謝。因此，試驗(yàn)最佳初始pH值為6.0。

2.1.2 乳酸菌總接種量對SOD活力的影響

圖2 接種量對SOD活力的影響Fig. 2 Effect of inoculum on SOD activity

由圖2可知，SOD活力在總接種量在2.5%之前逐漸上升，在2.5%達(dá)到峰值，隨后呈下降趨勢，推測在空間物質(zhì)充裕的情況下，乳酸菌代謝活動與菌密度呈正比，但當(dāng)乳酸菌密度過高時，乳酸菌的代謝活動因空間、營養(yǎng)物質(zhì)等因素減緩。因此，試驗(yàn)最佳接種量為2.5%。

2.1.3 發(fā)酵時間對SOD活力的影響

圖3 發(fā)酵時間對SOD活力的影響Fig 3 Effect of fermentation time on SOD activity

由圖3可知，SOD活力在48 h內(nèi)隨發(fā)酵時間基本呈上升趨勢，48 h達(dá)到峰值，推測在48 h內(nèi)乳酸菌處于生長代謝旺盛期，48 h以后隨著乳酸菌的密度增高和衰老轉(zhuǎn)而消耗營養(yǎng)產(chǎn)物，使得次級代謝產(chǎn)物減少，SOD活力降低。因此，試驗(yàn)最佳發(fā)酵時間為48 h。

2.1.4 接種比例對SOD活力的影響

接種比例對SOD活力的影響如圖4所示，結(jié)果表明，植物乳桿菌與副干酪乳桿菌比例過高或者過低時，SOD活力都比較低，植物乳桿菌∶副干酪乳桿菌=1∶1時，SOD活力最高，因此選用植物乳桿菌∶副干酪乳桿菌=1∶1為最佳接種比例。

圖4 接種比例對SOD活力的影響Fig. 4 Effect of inoculation ratio on SOD activity

2.2 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，以初始pH值、接種量、發(fā)酵時間、植物乳桿菌與副干酪乳桿菌接種比例為評價因素，以SOD活力為評價指標(biāo)進(jìn)行正交試驗(yàn)，試驗(yàn)結(jié)果與分析見表2，正交試驗(yàn)結(jié)果方差分析見表3。

表2 發(fā)酵條件優(yōu)化正交試驗(yàn)結(jié)果與分析Table 2 Results and analysis of orthogonal experiments for fermentation conditions optimization

表3 正交試驗(yàn)結(jié)果方差分析Table 3 Variance analysis of orthogonal experiments results

由表2正交試驗(yàn)結(jié)果極差分析可知，各因素對SOD活力影響次序?yàn)锳＞C＞B＞D。由表2可知，最佳發(fā)酵工藝為A1B3C3D3。遂發(fā)酵工藝條件為A1B3C3D3不變，即初始pH5.5，接種量4%，接種比例（植∶副）2∶1，發(fā)酵48 h。由表3方差分析結(jié)果可知，A、C因素對結(jié)果均有顯著性影響（P＜0.05），B、D因素對結(jié)果無顯著性影響（P＞0.05）。

2.3 驗(yàn)證試驗(yàn)

在上述最佳條件下，進(jìn)行平行試驗(yàn)5次，SOD活力值依次為：4.06 U、4.09 U、4.05 U、4.11 U、4.08 U，平均值為4.08 U，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.585%。由此可得此試驗(yàn)設(shè)計(jì)合理。

2.4 解酒防醉實(shí)驗(yàn)

表4 小鼠解酒防醉實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 4 Results of hangover and anti-drunk experiment of mice

由表4可知，與模型組相比，葛根水提液組醉酒潛伏期顯著延長、醉酒時間顯著縮短（P＜0.05），葛根發(fā)酵液組與陽性組醉酒潛伏期極顯著延長（P＜0.01），醉酒時間極顯著縮短（P＜0.01），且葛根發(fā)酵液組防醉解酒效果強(qiáng)于水提液組（P＜0.05）。

2.5 血清AST、ALT活力檢測

小鼠血清AST、ALT活力檢測結(jié)果如圖5所示。給藥8 d后，與陰性組相比，模型組血清ALT和AST活力極顯著升高（P＜0.01），與模型組相比，陽性組、葛根水提液組、葛根發(fā)酵液組小鼠血清AST、ALT活力顯著或極顯著降低（P＜0.05或P＜0.01）。并且葛根發(fā)酵液組作用優(yōu)于水提液組（P＜0.05）。

圖5 小鼠血清AST、ALT含量檢測結(jié)果Table 5 Determination results of AST and ALT contents in mice serum

2.6 肝臟SOD活力檢測

肝臟SOD活力檢測結(jié)果如圖6所示，與陰性組相比，模型組小鼠肝臟SOD活力極顯著下降（P＜0.01），與模型組相比，陽性組、葛根發(fā)酵液及水提液組小鼠肝臟SOD活力極顯著上升（P＜0.01）。且葛根發(fā)酵組優(yōu)于水提液組（P＜0.05）。

圖6 小鼠肝臟SOD活力檢測結(jié)果Fig. 6 Determination results of SOD activity in mice liver

3 結(jié)論

本試驗(yàn)通過植物乳桿菌和副干酪乳桿菌混合發(fā)酵，研究了葛根水提液乳桿菌發(fā)酵前后抗氧化活性、對小鼠解酒防醉效果以及酒精性肝損傷的保護(hù)作用的變化。通過正交試驗(yàn)，得到葛根水提液的最佳發(fā)酵工藝為初始pH5.5，接種量4%，接種比例（植∶副）2∶1，發(fā)酵時間48 h，較對照組及發(fā)酵前抗氧化成分SOD活性均升高，一定程度上延長小鼠醉酒潛伏期并縮短醉酒時間（P＜0.05或P＜0.01），緩解了肝損傷引起的小鼠血清中AST、ALT活力升高，并提高小鼠肝臟SOD活力。綜上所述，植物乳桿菌和副干酪乳桿菌雙菌發(fā)酵可提高葛根的抗氧化能力及對小鼠急性醉酒的解酒防醉能力，增強(qiáng)小鼠肝臟的抗氧化能力，并且可一定程度上對小鼠酒精性肝損傷起保護(hù)作用。