乳酸菌胞外多糖發酵條件優化及抗腫瘤活性的研究

胡盼盼

（1.呂梁學院 生命科學系，山西 呂梁033000；2.山西農業大學 動物科技學院，山西 晉中030801）

乳酸菌（lactic acid bacteria，LAB）是一種存在于人類體內的益生菌[1-3]，能夠將碳水化合物發酵成乳酸，具有降低膽固醇、抗氧化等生物活性[4-5]。LAB在生長代謝過程中能夠生產兩類胞外多糖（expolysaccharides，EPS），一類是由同一種單糖組成的同多糖（homopolysaccharide，HoPS）；一類是由含有兩個以上不同單糖的重復單元組成的雜多糖（heteropolysaccharide，HePS）[7-9]。LAB產生的EPS無毒、能夠調節機體胃腸道正常菌群、保持微生態平衡、降低血清膽固醇、抑制腸道內腐敗菌生長繁殖，制造營養物質、刺激組織發育，從而對機體營養狀態、生理功能、細胞感染、腫瘤反應和突然的應急反應等產生作用[10-12]，常被用作功能性食品成分。此外，還作為天然添加劑如增稠劑、穩定劑、乳化劑、起泡劑和凝膠劑等應用于食品、化工和醫藥領域[6]。

近幾十年來，由于微生物胞外多糖在產品結構、性能及生產方面所具有的特別優勢而得到大力研究開發[13-14]。同時，乳酸菌又是食品級工業生產菌，與其他菌相比安全性高，所以近年來對乳酸菌胞外多糖的研究逐漸增多。但是除了腸膜明串珠菌（Leuconostoc mesenteroides）所產的右旋糖酐現已工業化以外，產量低，菌株穩定性差仍是制約乳酸菌胞外多糖廣泛應用的首要因素，因此需要不斷摸索各種方法來提高乳酸菌胞外多糖產量[15-17]。

本研究以副干酪乳桿菌副干酪亞種（Lactobacillus paracaseisubsp.paracasei）M5L為研究對象，采用單因素試驗及響應面試驗對其產胞外多糖的發酵條件進行優化，并對胞外多糖的抗腫瘤活性進行初步研究，對乳酸菌胞外多糖更加廣泛的應用具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌株與細胞

副干酪乳桿菌副干酪亞種（Lactobacillusparacaseisubsp.paracasei）M5L：由哈爾濱工業大學化工學院食品科學與工程系從新疆馬奶酒中分離鑒定[11]；Caco-2細胞：中國科學院。

1.1.2 培養基

MRS培養基：北京畢特博生物技術有限責任公司；杜氏改良Eagle（Dulbecco's modified Eagle，DEME）培養基：上海玉博生物科技有限公司。

1.1.3 主要試劑

胎牛血清：賽業生物科技有限公司；無水乙醇、三氯乙酸、硫酸、苯酚、正丁醇、二甲基亞砜、磷酸緩沖鹽溶液（phosphate buffer saline，PBS）、濃硫酸、葡萄糖等均為國產分析純。

1.2 儀器與設備

S-1-150S高速離心機：德國Sigma公司；VS-502FD凍干機：河南海克爾儀器儀表有限公司；BPN-50CHUV細胞培養箱：濟南來寶醫療器械有限公司；CKX53倒置顯微鏡：南京衡橋儀器有限公司；CT115C滅菌鍋：姜堰市新康醫療器有限公司；GH86超凈工作臺：蘇州博立斯凈化科技有限公司；InfiniteM200酶標儀：瑞士TECAN公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 乳酸菌胞外多糖的生產

將凍存的乳酸菌M5L干粉接種于MRS液體培養基中，42 ℃條件下培養10 h，活化兩代使其恢復活力，得到發酵種子液（109CFU/mL）。按照2%（V/V）的接種量將種子液接種于MRS液體培養基中，裝液量為100 mL/250 mL，37 ℃條件下發酵8 h。

1.3.2 乳酸菌胞外多糖的提取及檢測

發酵液經100 ℃串氣滅酶活，10 000 r/min離心20 min，去除菌體，加入10%的三氯乙酸，4 ℃靜置隔夜，12 000 r/min離心30 min，除去蛋白，再加入3倍體積分數為95%的乙醇，4 ℃靜置隔夜，12 000 r/min離心20 min，得到多糖沉淀，雙蒸水（ddH2O）溶解多糖后，采用苯酚-硫酸法對多糖含量進行測定，最后將糖液冷凍干燥備用[18-19]。

1.3.3 乳酸菌M5L產胞外多糖發酵條件優化的單因素試驗

初始pH值的優化：按2%（V/V）的接種量將乳酸菌M5L種子液接種于初始pH值分別為4.5、5.5、6.5、7.5和8.5的MRS液體培養基中，裝液量為100 mL/250 mL，在37 ℃條件下分別發酵8 h，提取胞外多糖并對胞外多糖含量進行測定。

菌體濃度的優化：按2%（V/V）的接種量將菌體濃度分別為105CFU/mL、106CFU/mL、107CFU/mL、108CFU/mL、109CFU/mL的乳酸菌M5L菌液接種于MRS液體培養基中，初始pH值為7.5，裝液量為100 mL/250 mL，在37 ℃條件下分別發酵8 h，提取胞外多糖并對胞外多糖含量進行測定。

發酵溫度的優化：按2%（V/V）的接種量將乳酸菌M5L種子液接種于MRS液體培養基中，初始pH值為7.5，裝液量為100 mL/250 mL，分別在25 ℃、30 ℃、37 ℃、42 ℃條件下發酵8 h，提取胞外多糖并對胞外多糖含量進行測定。

發酵時間的優化：按2%（V/V）的接種量將乳酸菌M5L種子液接種于MRS液體培養基中，初始pH為7.5，裝液量為100 mL/250 mL，在37 ℃條件下分別發酵8 h、12 h、24 h、36 h和48 h，提取胞外多糖并對胞外多糖含量進行測定。

1.3.4 乳酸菌M5L產胞外多糖發酵條件優化響應面試驗

在單因素試驗的基礎上，選取發酵溫度（A）、發酵時間（B）、菌體濃度（C）、初始pH值（D）為考察因素，以胞外多糖產量（Y）為響應值，采用中心組合設計（central composite design，CCD）法進行4因素3水平響應面試驗，對乳酸菌M5L產胞外多糖濃度發酵條件進行優化，試驗因素與水平見表1。

表1 乳酸菌M5L產胞外多糖發酵條件優化響應面試驗因素與水平Table 1 Factors and levels of response surface tests for fermentation conditions optimization of exopolysaccharides by lactic acid bacteria

1.3.5 乳酸菌胞外多糖抗腫瘤活性的測定

噻唑藍（methyl thiazolyl tetrazolium，MTT）法[11]：調整Caco-2的細胞濃度為106個/mL到96孔板中，分別加入質量濃度為0 μg/mL、250 μg/mL、500 μg/mL和750 μg/mL的乳酸菌胞外多糖。每個質量濃度5個平行。在5%CO2、37 ℃條件下培養24 h、48 h、72 h后吸出培養液，每孔加入150 μL PBS清洗兩次，然后每孔中加入0.5 mg/mL的MTT 100 μL，37 ℃繼續培養4 h，吸出MTT后每孔中加入150 μL二甲基亞砜，置于搖床振蕩10 min，最后用酶標儀在波長490 nm處測定吸光度值，計算腫瘤細胞抑制率，其計算公式如下：

實時熒光定量聚合酶鏈式反應（real time-fluorescent quantitative polymerase chain reaction，RT-FQPCR）[20]：采用乳酸菌胞外多糖孵育Caco-2細胞72 h后，采用Trizol法提取Caco-2細胞的總核糖核酸（ribonucleic acid，RNA），參照逆轉錄試劑盒說明逆轉錄為互補脫氧核糖核酸（complementaryDNA，cDNA）。再以cDNA為模板，進行RT-FQPCR擴增，檢測Caco-2細胞中抑凋亡基因Bcl-2、促凋亡基因Bax和Caspase-3信使核糖核酸（messenger ribonucleic acid，mRNA）的表達水平。

1.3.6 數據分析

每組試驗重復3次，采用Origin 8.0、Design Expert 8.0.6軟件對數據進行作圖和統計分析。試驗結果以“平均值±標準偏差”表示。

2 結果與分析

2.1 乳酸菌M5L產胞外多糖發酵條件優化單因素試驗結果

2.1.1 初始pH值對乳酸菌胞外多糖得率產量的影響

菌體生長需要適宜的pH值，初始pH值可以通過影響菌體生長進而影響多糖產量。不同初始pH值對乳酸菌M5L產胞外多糖的影響見圖1。由圖1可知，隨著初始pH值的增加，乳酸菌胞外多糖產量呈現先升高后下降的趨勢，當初始初始pH值為7.5時，胞外多糖產量最高，為127.7 mg/mL，說明過酸過堿均可影響菌體胞外多糖的產量。因此，確定最佳初始pH值為7.5。

圖1 初始pH值對胞外多糖產量的影響Fig. 1 Effect of initial pH on exopolysaccharides yield

2.1.2 菌體濃度對乳酸菌胞外多糖產量的影響

接種量可以直接影響單位發酵液中的菌體數量，從而影響最終胞外多糖的產量。不同菌體濃度對乳酸菌M5L產胞外多糖的影響見圖2。

圖2 菌體濃度對胞外多糖產量的影響Fig. 2 Effect of cell concentration on exopolysaccharides yield

由圖2可知，隨著菌體濃度不斷增加，胞外多糖產量呈先增加后減少的趨勢。當菌體濃度為108CFU/mL時，胞外多糖產量達到最高，為131.2 mg/mL。因此，選擇最佳菌體濃度為108CFU/mL。

2.1.3 發酵溫度對乳酸菌胞外多糖產量的影響

溫度是影響胞外多糖發酵產量的重要因素，不同發酵溫度對乳酸菌M5L產胞外多糖的影響見圖3。由圖3可知，當發酵溫度為37 ℃時，乳酸菌胞外多糖產量達到最高，為132.7 mg/mL。因此，確定最佳發酵溫度為37 ℃。

圖3 發酵溫度對胞外多糖產量的影響Fig. 3 Effect of fermentation temperature on exopolysaccharides yield

2.1.4 發酵時間對胞外多糖產量的影響

發酵時間對乳酸菌M5L產胞外多糖的影響見圖4。由圖4可知，發酵時間對乳酸菌M5L產胞外多糖影響較大，當發酵時間為12 h時，乳酸菌胞外多糖產量達到最高，為147.1 mg/mL。隨后產量降低，這可能是由于培養基碳源的含量減少，導致菌體消耗自身產的多糖所致。因此，確定最佳發酵時間為12 h。

圖4 發酵時間對胞外多糖產量的影響Fig. 4 Effect of fermentation time on exopolysaccharides yield

2.2 乳酸菌M5L產胞外多糖發酵條件優化響應面試驗結果

2.2.1 響應面試驗設計及結果

根據單因素試驗結果，以發酵溫度（A）、發酵時間（B）、菌體濃度（C）及初始pH值（D）為考察因素，胞外多糖產量（Y）為響應值，進行4因素3平響應面分析，試驗設計及結果見表2，方差分析見表3。

表2 乳酸菌M5L產胞外多糖發酵條件優化響應面試驗設計及結果Table 2 Design and results of response surface tests for fermentation conditions optimization of exopolysaccharides by lactic acid bacteria M5L

根據表2所得試驗數據，采用Desigh-Expert 8.0.6進行多元回歸擬合，得到乳酸菌胞外多糖產量對試驗因素的二次多項回歸方程：Y=161.50+9.67A+1.99B+10.60C+32.28D+5.40AB+9.33AC-2.02AD-8.38BC+1.20BD+8.90CD-22.59A2-18.20B2-25.21C2-18.98D2。

方程中各項系數絕對值的大小可以直接反映各因素對響應值的影響程度，系數的正負號則反映了影響的方向。由二次項系數均為負數可知方程所代表的拋物線開口向下，因此方程有極大值，可以用來優化分析。由方程的一次項系數可以得出，影響乳酸菌M5L產胞外多糖的因素依次為初始pH值＞菌體濃度＞發酵溫度＞發酵時間。

表3 回歸模型的方差分析Table 3 Variance analysis of regression model

由表3可知，方程的模型的P值＜0.000 1，極顯著，說明模型有意義；失擬項P值=0.646 1＞0.05，不顯著；即模型與試驗值之間的誤差較小；決定系數R2=0.982 2，說明此模型可以解釋98.22%的數據；變異系數（variable coefficient，CV）=4.57%，CV值較小，說明試驗誤差較小。此外，一次項A、C、D及二次項A2、B2、C2、D2對結果影響極顯著（P＜0.01），交互項AC、AD、BC及CD對結果影響顯著（P＜0.05），而其他項對結果影響不顯著（P＞0.05）。通過F值可知，影響乳酸菌M5L產胞外多糖的因素的主次順序為初始pH值＞菌體濃度＞發酵溫度＞發酵時間，與模型中回歸線性方程的分析相吻合。

2.2.2 響應面分析圖

各因素交互作用對乳酸菌M5L產胞外多糖的影響的響應面及等高線見圖5。

由圖5可知，所有響應面開口均朝下，存在極大值。胞外多糖含量均隨發酵時間、發酵溫度、初始pH值及菌體濃度的變化呈先增大后減小的趨勢，且各因素極大值分別為發酵時間12 h、發酵溫度37 ℃、初始pH值7.5、菌體濃度108CFU/mL。

圖5 各因素間交互作用對胞外多糖產量影響的響應面及等高線Fig. 5 Response surface plots and contour lines of effects of interaction between each factor on exopolysaccharides yield

2.2.3 驗證試驗

通過響應面試驗優化分析，確定乳酸菌M5L產胞外多糖的最佳發酵工藝條件為發酵溫度37.19 ℃，初始pH值7.72，菌體濃度108.31CFU/mL，發酵時間12.79 h。胞外多糖產量的最大預測值為167.5 mg/mL。根據實際情況，將最優條件修訂為發酵溫度37 ℃，發酵時間12.8 h，初始pH值7.7，菌體濃度108CFU/mL，在此最優發酵條件下，進行三組驗證性試驗，胞外多糖平均產量實際值為167.2 mg/mL，與預測值之間擬合較好，誤差在允許范圍內，說明利用響應面法優化結果分析是可行的、有效的。

2.3 乳酸菌胞外多糖抗腫瘤活性的測定

2.3.1 MTT試驗結果

采用MTT法測定乳酸菌胞外多糖的抗腫瘤活性，結果見圖6。

圖6 噻唑藍法乳酸菌胞外多糖抗腫瘤活性測定結果Fig. 6 Determination results of antitumor activity of exopolysaccharides of lactic acid bacteria by methyl thiazolyl tetrazolium method

由圖6可知，乳酸菌胞外多糖對腫瘤細胞的抑制率呈現出時間和質量濃度依賴性，即時間越長，質量濃度越大，對Caco-2細胞的抑制效果越好。胞外多糖作用于Caco-2細胞72 h后，其腫瘤細胞抑制率顯著高于作用24 h和48 h，且當胞外多糖質量濃度為500 μg/mL和750 μg/mL處理72 h后，腫瘤抑制率相差不大。因此，選擇質量濃度為500 μg/mL的胞外多糖作用72 h用于后續的研究。

2.3.2 RT-FQPCR結果

以未經胞外多糖處理的Caco-2細胞為對照，采用RTFQPCR測定經質量濃度為500 μg/mL的胞外多糖作用72 h后的Caco-2細胞中的促凋亡基因Bax、抑凋亡基因Bcl-2及促凋亡基因Caspase-3的表達量，結果見圖7。

圖7 Caco-2細胞中凋亡相關基因的表達量Fig. 7 Expression quantity of apoptosis-related gene in Caco-2 cells

Bcl-2家族蛋白是細胞凋亡過程中重要的凋亡蛋白之一，其蛋白家族中的Bax蛋白具有促進凋亡的作用，Bcl-2蛋白可以抑制細胞的凋亡[11]。Caspase是一類天冬氨酸特異性的半胱氨酸蛋白酶，在人類細胞中Caspase-3的超量表達和激活均會引起細胞凋亡，因此，又稱死亡蛋白酶[11]。由圖7可知，與未經乳酸菌胞外多糖處理的對照組相比，乳酸菌胞外多糖處理組可以顯著提高Caco-2細胞中促凋亡基因Bax的表達量（P＜0.05），顯著降低抑凋亡基因Bcl-2的表達量（P＜0.05），因此Bax/Bcl-2比值變大，且Caco-2細胞中Caspase-3的表達量顯著升高（P＜0.05），說明乳酸菌M5L所產胞外多糖可通過影響凋亡相關蛋白的表達來促進Caco-2細胞凋亡。

3 結論

采用單因素及響應面試驗優化得出副干酪乳桿菌副干酪亞種（Lactobacillus paracaseisubsp.paracasei）M5L產胞外多糖的最優發酵條件為發酵溫度37 ℃，發酵時間12.8 h，初始pH值7.7，菌體濃度為108CFU/mL。在此最優發酵條件下，胞外多糖產量為167.2 mg/mL，是優化前（128.3 mg/mL）的1.3倍。該胞外多糖可通過影響凋亡相關蛋白的表達來促進Caco-2細胞凋亡，當質量濃度為500 μg/mL的胞外多糖作用于Caco-2細胞72 h時，腫瘤抑制率達到19.5%。