紅茂草多糖提取工藝優化及對小鼠免疫功能的影響

趙 強，李 昭，楊勸生，馬 坤，趙陽安，趙金鳳

（1.天水師范學院 生物工程與技術學院，甘肅 天水741001；2.甘肅工業職業技術學院 化工學院，甘肅 天水741025）

紅茂草[Dicranostigma leptodum（Maxim.）Fedde（DLF）]在《本草綱目》中記載為禿瘡花、石長生等，且為野生，始于獸用，是陜甘地區民間習用藥材，在甘肅秦嶺南北、渭水流域分布最為廣泛[1-3]。其可用于治療羊口瘡、創傷性炎癥、皮膚毛囊炎、扁桃腺炎，咽喉腫痛、淋巴結核、禿疤疥癬等癥[4-7]。近年來，有學者主要針對紅茂草生物堿、揮發油、黃酮類等有效成分進行分離提取，制成不同的藥物劑型，從免疫學、毒理學、病理學等方面對其進行了大量的基礎研究，尤其發現紅茂草生物堿抑菌抗炎作用十分顯著[8-10]。

多糖具有多種重要生物活性，有研究表明，紅茂草制劑有促進小鼠脾細胞增殖，使T細胞增殖與活化；刺激巨噬細胞活化及細胞因子分泌；誘導并促使IL-2的分泌，增加紅細胞免疫功能；對小鼠實驗性肝損傷有保護作用，對化學試劑誘發的溶血有一定的抑制作用；小鼠腹腔注射紅茂草提取物后，與模型組比較，紅細胞數目增加，血紅蛋白含量提高，白細胞數目減少，血漿丙二醛含量降低，四項指標均接近正常組[11-14]。為系統了解紅茂草多糖的生物學功能，該研究通過正交法確定了紅茂草多糖的提取工藝，將其作用于環磷酰胺誘導的免疫功能低下小鼠，并對其免疫功能進行研究，為該藥材的深層次開發利用提供一定的理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 樣品

紅茂草：采于甘肅省天水市甘谷縣新興鎮北山陽坡，經甘肅省畜牧獸醫研究所鑒定。

1.1.2 試劑

葡萄糖標準品（純度≥98%）：北京索萊寶科技有限公司；小牛血清（規格100 mL）、補體（豚鼠血清）（純度≥99%）、巴比妥酸（純度≥98%）：上海麥克林生物試劑公司；環磷酰胺（cyclophosphamide，CY）（純度≥98%）：山西普德藥業有限公司；巴比妥鈉（純度≥99%）、酚紅（分析純）、微孔濾膜（0.22 μm）：廣州捷倍斯生物科技有限公司；Hank's液（pH=7.2～7.4）、氫氧化鈉、濃硫酸、無水乙醇等均為國產分析純。

1.1.3 試驗動物

40日齡BALB/c試驗小鼠（18～20 g）100只，雌雄各半購自甘肅省畜牧獸醫研究所。

1.2 儀器與設備

UV-751GD型紫外-可見光分光光度計：上海分析儀器廠；RE52-99型旋轉蒸發儀：上海亞榮生化儀器廠；AB104-S型電子分析天平：瑞士梅特勤公司；TD5A-WS型低速離心機：湖南湘儀試驗室儀器開發有限公司；CR21G II型高速冷凍離心機：天美科技有限公司；CL-40S型全自動高壓滅菌鎘：日本ALP公司；51型筆式pH酸度計：上海牧晨電子技術有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 紅茂草多糖提取工藝流程及操作要點

稱取紅茂草干草粉末50g，經風干、粉碎、過篩，用150mL體積分數95%乙醇溶液浸泡24 h后，轉入索氏提取器，70 ℃回流熱處理2 h，進行抽濾，50 ℃真空干燥，得到預處理樣品（粗品）。再將預處理得到的紅茂草樣品加入100 mL蒸餾水，80 ℃索氏回流提取2 h，轉入旋轉蒸發儀濃縮、抽濾，濾液再經濃縮后加入等體積無水乙醇進行醇沉。靜置、抽濾，沉淀依次用無水乙醇、丙酮、乙醚潤洗，將沉淀轉入真空干燥箱中干燥，得紅茂草多糖。

1.3.2 多糖含量的測定

葡萄糖標準曲線的繪制：分別取質量濃度為0、20μg/mL、40 μg/mL、60 μg/mL、80 μg/mL、100 μg/mL[15]、120 μg/mL葡萄糖標準品溶液1 mL置于試管中，各加6%苯酚溶液1.8 mL，搖勻，分別再迅速滴加濃硫酸7.5 mL，搖勻后水浴20 min，冷卻至室溫。另以蒸餾水作空白試驗。紫外分光光度計于波長483 nm處測吸光度值，以吸光度值（Y）對葡萄糖質量濃度（X）繪制葡萄糖標準曲線，得標準曲線回歸方程Y=0.004 7X+0.010 2，相關系數R2=0.990 5。

按照標準曲線回歸方程計算樣品中多糖含量，并計算多糖產率[8]，其計算公式如下：

1.3.3 多醣提取條件優化正交試驗[15-17]

在單因素試驗的基礎上，以超聲波處理時間、料液比、索氏回流時間、醇沉時間、酸堿度和乙醇體積分數為影響紅茂草多糖提取效果的主要考察因素，采用正交試驗設計，其因素與水平見表1。

表1 紅茂草多糖提取條件優化正交試驗因素與水平Table 1 Factors and levels of orthogonal experiments for extraction conditions optimization of Dicranostigma leptodum polysaccharides

1.3.4 紅茂草多糖對小鼠免疫功能的影響

（1）動物免疫抑制模型

選取50只BALB/c試驗小鼠（18～20 g），雌雄各半，一周適應性喂養后，隨機分為5組，每組10只。第1組為生理鹽水對照組，每天灌胃無菌生理鹽水0.5 mL；第2組為環磷酰胺陽性對照組，每天灌胃0.9%的生理鹽水0.5 mL，連續灌胃3 d后，隔天腹腔注射100 mg/kg環磷酰胺，共注射5次；第3、4、5組為紅茂草多糖試驗組，各組分別按100 mg/kg、200 mg/kg、400 mg/kg的劑量每天灌胃紅茂草多糖，連續灌胃3 d后，各試驗組灌胃的同時隔天腹腔注射100 mg/kg環磷酰胺，共注射5次[18]。

（2）胸腺指數和脾臟指數的測定

按照1.3.4（1）方法構建模型，最后一次注射環磷酰胺3 d后，將建模小鼠稱質量、處死，摘取胸腺、脾臟，生理鹽水漂洗，濾紙吸干水分，稱質量，計算胸腺指數和脾臟指數，其公式如下：

（3）對免疫功能低下小鼠遲發型變態反應、抗體生成細胞和血清溶血素含量的影響

按照1.3.4（1）方法構建的動物模型，最后一次注射環磷酰胺3 d后，全部小鼠腹腔注射2%綿羊紅細胞（sheep red blood cells，SRBC）0.2 mL/只，當小鼠經2%的SRBC免疫3 d后，測量全部小鼠左后足趾的厚度，而后在其足趾皮下注射20%的SRBC 20 μL（約1×108SRBC），并與注射后24 h、48 h各測一次同一部位的足趾厚度，免疫5 d后將所有供試小鼠稱質量，眼眶采血，室溫條件下放置30 min，2 500 r/min離心10 min，取血清分裝，備用；小鼠斷頸椎處死，無菌條件下取其脾臟，生理鹽水漂洗，濾紙吸干水分，稱質量。參考張錦錦等[19]的方法，分別測定紅茂草多糖對免疫功能低下小鼠遲發性變態反應、對抗體生成細胞的影響和對血清半數溶血值（50%hemolytic value，HC50）的影響。

SRBC半數溶血值：取10%SRBC，0.25 mL，加SA液至4 mL，測定OD540nm值。

（4）巨噬細胞吞噬功能的檢測

按照1.3.4方法構建模型，最后一次注射環磷酰胺48 h后，每只小鼠腹腔注射5%雞紅細胞1 mL，2 h后頸椎脫臼法處死小鼠，腹腔中注射含5%小牛血清的Hank's液2 mL，輕揉小鼠腹部1 min，在腹部剖一小口，用吸管吸取腹腔液，將各處理組小鼠腹腔液混合，涂片，將其放入墊有濕紗布的瓷盤中，置于37 ℃恒溫箱中30 min，而后用生理鹽水沖洗懸浮的細胞，室溫條件下晾干，Giemsa染色10 min，蒸餾水沖洗多余染料，晾干、計數，每片計數200個吞噬細胞，計算吞噬率和吞噬指數[20-21]。

1.3.5 數據處理

SPSS 22.0統計軟件，對各組數據進行差異顯著性分析。

2 結果與分析

2.1 多糖提取工藝優化正交試驗

在單因素試驗的基礎上，以超聲波處理時間、料液比、索氏回流時間、醇沉時間、酸堿度和醇沉濃度為影響紅茂草多糖提取效果的主要考察因素，采用正交試驗設計優化多糖提取條件，正交試驗結果與分析見表2，正交試驗結果方差分析見表3。

表2 紅茂草多糖提取條件優化正交試驗結果與分析Table 2 Results and analysis of orthogonal experiments for extraction conditions optimization of Dicranostigma leptodum polysaccharides

續表

表3 正交試驗結果方差分析Table 3 Variance analysis of orthogonal experiments results

由表2可知，影響紅茂草多糖產率的主次因素為B＞F＞C＞E＞A＞D，優選出的最佳提取工藝組合為A4B3C4D4E2F3，即超聲波處理35 min、料液比為1∶20（g∶mL）、索氏回流160 min、醇沉28 h、pH為5和乙醇體積分數80%。按此工藝條件其多糖產率可達1.19%。由表3可知，僅C因素對結果影響達顯著水平（P＜0.05）。

2.2 對小鼠胸腺指數和脾臟指數的影響

以環磷酰胺為免疫抑制劑，100 mg/kg劑量連續對小鼠腹腔注射5次，成功構建小鼠免疫抑制模型。由表4可知，與對照組相比，CY組胸腺指數和脾臟指數均明顯下降，說明免疫抑制造模成功。不同濃度的紅茂草多糖灌胃配合CY腹腔注射處理組，與CY組相比，100 mg/kg、200 mg/kg、400 mg/kg的紅茂草多糖可對抗CY造成的免疫抑制，對脾臟指數和胸腺指數有不同程度的提升作用，差異極顯著（P＜0.01）。給免疫功能低下小鼠灌服紅茂草多糖溶液，在100～400 mg/kg質量濃度范圍內，紅茂草多糖對小鼠胸腺指數和脾臟指數呈明顯上升趨勢，能顯著提高小鼠脾臟指數和胸腺指數（P＜0.05），表明紅茂草多糖促進了小鼠脾臟和胸腺的生長發育，進而增強機體免疫功能。

表4 紅茂草多糖對免疫功能低下小鼠胸腺指數、脾指數的影響Table 4 Effect of Dicranostigma leptodum polysaccharides on thymus index and spleen index of low immune mice

2.3 對免疫功能低下小鼠的影響

2.3.1 對免疫功能低下小鼠遲發型變態反應的影響

小鼠足趾皮下注射10%SRBC前、注射10%SRBC 24 h和48 h后各測量一次試驗鼠足趾厚度。由表5可知，CY組能顯著降低小鼠遲發性變態反應的能力，空白對照組24 h和48 h足趾厚度與CY組相比均有極顯著差異（P＜0.01），說明CY能夠降低遲發性變態反應的能力，造模成功。與CY組相比，紅茂草多糖三個劑量組對小鼠遲發型變態反應作用在24 h和48 h均極顯著提高（P＜0.01），說明紅茂草多糖能夠提高免疫低下小鼠遲發性變態反應。

表5 紅茂草多糖對免疫功能低下小鼠遲發型變態反應的影響Table 5 Effect of Dicranostigma leptodum polysaccharides on delayed allergic reaction of low immune mice

2.3.2 對免疫功能低下小鼠抗體生成細胞的影響

通過定量溶血分光光度法測定紅茂草多糖對免疫功能低下小鼠抗體生成細胞的影響。由表6可知，與空白對照組相比，CY組小鼠脾淋巴細胞光密度差值極顯著降低（P＜0.01），說明CY可抑制小鼠脾淋巴細胞的增殖轉化，建模成功；紅茂草多糖處理組與CY組相比，小鼠脾淋巴細胞光密度差值極顯著升高（P＜0.01），且隨紅茂草多糖劑量的提高而增大，表明紅茂草多糖能提高免疫功能低下小鼠抗體生成細胞分泌抗體的能力，和劑量呈正相關性，反映高濃度多糖對免疫功能低下小鼠抗體生成細胞分泌抗體的促進作用更加明顯，紅茂草多糖能一定程度上逆轉CY所致的小鼠淋巴細胞增殖轉化能力的降低，增強小鼠的細胞免疫功能。

表6 紅茂草多糖對免疫功能低下小鼠抗體生成細胞的影響Table 6 Effect of Dicranostigma leptodum polysaccharides on antibody-producing cells of low immune mice

2.3.3 對免疫功能低下小鼠血清溶血素含量的影響

血清半數溶血值（HC50）變化是評定藥物對體液免疫作用效果的一個重要指標。由表7可知，與CY組相比，100 mg/kg、200 mg/kg、400 mg/kg的紅茂草多糖均能顯著提高小鼠血清半數溶血值，100 mg/kg差異顯著（P＜0.05），200 mg/kg和400 mg/kg組差異極顯著（P＜0.01）；與空白對照組比較，紅茂草多糖處理組均低于空白組，100 mg/kg和200 mg/kg差異極顯著（P＜0.01），400 mg/kg無顯著差異性（P＞0.05）。表明紅茂草多糖可以提高免疫功能低下小鼠血清溶血素含量，高濃度條件下可以使免疫功能低下小鼠血清溶血素接近正常水平。

表7 紅茂草多糖對免疫功能低下小鼠血清溶血素的影響Table 7 Effect of Dicranostigma leptodum polysaccharides on serum hemolysin of low immune mice

2.3.4 對免疫低下小鼠腹腔巨噬細胞的影響

由表8可知，與空白對照組相比，CY組巨噬細胞吞噬百分率極顯著降低（P＜0.01），說明免疫功能低下小鼠模型建立成功；紅茂草多糖200 mg/kg組的吞噬百分率與CY組相比顯著提高（P＜0.05），紅茂草多糖400 mg/kg組胞的吞噬百分率與CY組相比極顯著提高（P＜0.01），紅茂草多糖100 mg/kg組的吞噬百分率與CY組相比有所提高，但無顯著差異（P＞0.05）；紅茂草多糖處理組的吞噬指數與CY組相比有一定程度的提高，但無顯著差異性（P＞0.05），空白對照組吞噬指數略高于CY組，但也無統計學意義。表明紅茂草多糖作用于免疫抑制小鼠主要是促進巨噬細胞的增值和激活巨噬細胞，但對巨噬細胞本身的吞噬效率沒多大影響，紅茂草多糖能促進小鼠非特異性免疫功能。

表8 紅茂草多糖對免疫功能低下小鼠腹腔巨噬細胞的影響Table 8 Effect of Dicranostigma leptodum polysaccharides on peritoneal macrophage of low immune mice

3 結論

通過對紅茂草多糖提取的一系列影響因素進行考察，確定其最佳正交提取工藝為超聲波處理35 min、料液比為1∶20、索氏回流160 min、醇沉28 h、pH為5和體積分數80%的乙醇，按此工藝條件其多糖產率可達1.19%，對提取物進行性質檢測，確定其為多糖成分。將100 mg/kg的紅茂草多糖通過刺激巨噬細胞的增殖和活化來提高CY抑制小鼠的吞噬能力，從而使免疫功能低下小鼠非特異性免疫能力得以恢復，在100～400 mg/kg范圍內有劑量效應。400 mg/kg的紅茂草多糖可以提高CY抑制小鼠細胞免疫反應能力，從而使免疫功能低下小鼠非特異性免疫能力得以恢復，在100～400 mg/kg范圍內有劑量效應。紅茂草多糖通過刺激B淋巴細胞增殖的途徑來提高CY抑制小鼠細體液免疫反應能力，從而使免疫功能低下小鼠非特異性免疫能力得以恢復，從而提高免疫低下小鼠的免疫功能。

天然藥物成分中絕大多數多糖，不僅對正常細胞無毒副作用，而且能夠提高機體免疫功能，具有抗病毒、抗輻射、抗癌、降血糖、減肥和清除氧化自由基作用，其藥用潛力巨大。本研究為天然藥用植物紅茂草資源的深層次開發和利用，提供了一定的理論參考，也為該藥物今后的臨床應用提供了可靠的試驗依據。