天然油中游離谷氨酸、游離酪氨酸的含量測定

□ 柯粵振 伍 鎣 續 穎 李逸純 廣東美味鮮調味食品有限公司

天然油發酵是醬油生產過程中的重要工序，向成曲中加入一定量的水或者鹽水，經攪拌后裝入發酵容器中，并保持一定的溫度，利用微生物和微生物所分泌的各種酶將復雜的有機物分解成簡單的有機物的生化變化過程即為天然油發酵過程，醬油獨特的風味就是在發酵和老化過程中逐漸形成的[1]。

天然油發酵過程中會形成大量游離氨基酸[1]，游離氨基酸的產生使醬油具有特有的風味[2—3]，其中游離谷氨酸是主要的鮮味物質[2—4]，能賦予醬油鮮美的味道，準確測定天然油中游離谷氨酸的含量對醬油營養價值的提升具有積極意義。同時在天然油發酵過程中也會析出一種白色的物質附著在豆粒的表層，并逐漸形成圓形或片狀的白色顆粒，俗稱“白點”[5]，它的存在嚴重影響了產品的外觀。這些白點以酪氨酸為主，由多種氨基酸共同結晶而成[6]，準確測定天然油中游離酪氨酸的含量對改良醬油品質具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

氨基酸標準品(2.5 μmol/mL)：美國sigma公司；三氯乙酸：分析純；緩沖液 B1、B2、B3、B4、B6：日本日立公司；茚三酮溶液R1、R2：日本日立公司；鹽酸：優級純。

1.2 儀器和設備

L—8900全自動氨基酸分析儀：日本日立公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 樣品處理

準確吸取1 mL混合均勻的天然油于50 mL容量瓶中，用0.1 mol/L的HCl稀釋定容至50 mL，搖勻。再取2 mL稀釋液于5 mL離心管中，加入2 mL 1%三氯乙酸溶液去除蛋白質，10 000 r/min離心5 min，離心后上清液過0.22 μm濾膜進樣分析。

1.3.2 標準曲線的繪制

將氨基酸標準品（2.5 μmol/mL）用0.02 mol/L鹽酸溶液稀釋至0.1 nmol/μL 與 0.25 nmol/μL 的標準溶液，上機測定，以濃度為橫坐標，峰面積為縱坐標，強制過原點，繪制標準曲線。

1.3.3 色譜條件

色譜柱：日立鈉離子交換樹脂4.6 mm×60 mm；測定波長：570 nm和440 nm；柱溫：57 ℃；進樣體積：20 μL；流動相按梯度表（表 1）進行洗脫。

表1 梯度洗脫程序

2 結果與討論

2.1 標準曲線繪制

對1.3.2方法配制的標準溶液上機測定，分別繪制谷氨酸、酪氨酸標準曲線（圖1、圖2），強制過原點后相關系數r2均大于0.999，說明在測定范圍內線性關系良好。氨基酸標樣色譜圖（見圖3），出峰時間為30 min，所有氨基酸都得到了良好的分離，其中谷氨酸、酪氨酸的保留時間分別為6.813 min和18.287 min。

圖1 谷氨酸標準曲線

圖2 酪氨酸標準曲線

圖3 氨基酸標樣色譜圖（0.1 nmol/μL）

2.2 精密度

準確吸取天然油樣品6份，在相同條件下進行樣品處理和進樣分析，根據測定結果計算變異系數，結果（見表2），酪氨酸、谷氨酸的CV均小于2%，表明方法的重現性較好。

表2 天然油平行測定6次結果

2.3 加標回收率

將一定量標樣加入到天然油樣品中，然后與未加標樣的天然油平行進行前處理和進樣分析，根據酪氨酸、谷氨酸的測定值、計算回收率，結果（見表3），酪氨酸、谷氨酸回收率均在90%以上，說明測定結果較準確，該方法可以用于天然油中游離酪氨酸、游離谷氨酸的定量分析。

表3 酪氨酸、谷氨酸回收率

2.4 樣品的測定

采用本方法測定天然油樣品，色譜圖（見圖4），測定結果（見表4），酪氨酸、谷氨酸與其他組分分離良好，峰型好，干擾小。說明本方法比較適合測定天然油中的游離酪氨酸、游離谷氨酸的含量。

圖4 天然油游離氨基酸色譜圖

表4 天然油游離谷氨酸、游離酪氨酸測定結果

3 結論

本方法采用三氯乙酸去除天然油中蛋白后，用自動氨基酸分析儀測定游離酪氨酸與游離谷氨酸的含量，操作簡單、重現性好、回收率高、干擾小，是準確快速測定天然油中游離酪氨酸、游離谷氨酸的可靠方法。本方法對醬油工藝改良、品質提升的研究具有重要意義。