葡萄籽中蛋白質的提取

□ 溫小娟 吳 丹 烏海市檢驗檢測中心

賀蘭山東麓釀酒葡萄種植地是我國三大釀酒葡萄原產地之一。烏海市就位于該產地北側，且與世界紅酒之鄉—法國波爾多處于同一緯度（北緯39°），常年干旱少雨、葡萄生長季節晝夜溫差顯著、日照時間長、無霜期長，屬于溫帶大陸性氣候區，適宜葡萄生長，具有糖度高、色澤好、品質佳的特點，是種植葡萄的“黃金地帶”[1]。近年來烏海葡萄酒產業發展趨勢良好，興起多家葡萄酒企業，形成了集釀酒—農畜產品—旅游為一體的綠色沙漠葡萄酒產業鏈。全市4家大型葡萄酒加工企業中，漢森葡萄酒廠2014年的葡萄酒生產能力已達2萬噸，為內蒙古最大的葡萄酒生產加工企業[2]。據了解，在釀酒季這些葡萄酒廠往往會產生大量的葡萄籽、皮殘渣等副產物，而大部分釀酒副產物均作為粗飼料和肥料來使用，如能充分利用釀酒過程中產生的籽渣等副產物，則可進一步促進葡萄酒產業鏈的發展，在減少資源浪費、保護地區環境的同時，給企業創造更多的經濟價值。

1 葡萄籽蛋白質概述

葡萄籽中含有粗蛋白約8.0%、多酚約6.8%、碳水化合物約32.7%。籽中氨基酸豐富且含量均衡，共有18種，其中有甲硫氨酸（Met）、蘇氨酸（Thr）、纈氨酸（Val）、賴氨酸（Lys）、亮氨酸（Leu）、苯丙氨酸（Phe）、異亮氨酸（Ile）7種人體必需氨基酸[3]。且4種氨基酸與大豆蛋白的氨基酸含量非常接近，可運用于生產強化食品、保健食品等[4]。對葡萄籽提取物的深入、廣泛研究利用尚存在較大的發展空間，例如對葡萄籽進行蛋白質、多肽提取等[5]。

本文以釀酒后葡萄渣中的果籽為材料，選取來自兩個不同產地的葡萄籽（葡萄籽樣品1來自烏海，葡萄籽樣品2來自銀川）同時進行試驗。采用NaCl溶液提取法在不同影響因素下對葡萄籽中的蛋白質進行提取，改變粒度目數、浸提溶液濃度、溫度條件、固液比例與提取時間5種條件參數，利用單因素法分析各因素在不同實驗水平下對其蛋白提取程度的影響，再經正交試驗優化，從而最終選定最優的葡萄籽蛋白質浸提條件。

2 葡萄籽蛋白的提取工藝

2.1 工藝流程

葡萄籽→烘干→粉碎過篩→脫脂浸提沉淀→調pH值為中性→離心棄去上清液→等電點酸沉→離心取上清液→干燥去除水分→葡萄籽蛋白。

2.2 預處理

將兩種葡萄籽樣品放入烘箱中在55 ℃下烘12 h，烘干后粉碎，經目數為18、40、60與80目的篩子篩選。為避免葡萄籽粉中的油脂影響蛋白質提取，需用正己烷以1∶5的料液比對葡萄籽粉進行脫脂，時間為2 h，之后過濾，分離出的上清液中含葡萄籽油，沉淀則為脫脂后葡萄籽粕，重復3次，然后檢測葡萄籽粕中的蛋白。

3 NaCl溶液浸提法提取葡萄籽中所含蛋白質

3.1 單因素試驗

3.1.1 蛋白質浸提率受不同粉碎粒度（目數）作用的變化情況

準確稱量不同粒度（18、40、60與80目）的脫脂葡萄籽粕各1.000 g，分別放入4支50 mL離心管中，按固液比為1∶20各加入20 mL濃度為1.0 mol/L的NaCl溶液，在溫度為40 ℃的恒溫水浴箱中浸提40 min。設定離心機轉子速度為3 000 r/min，時間為15 min，保留經離心處理所得上清液，棄去沉淀。

3.1.2 蛋白質浸提率受不同NaCl濃度作用的變化情況

準確稱量粒度是60目的葡萄籽粉各1.000 g，放入50 mL離心管中，以固液比1∶20分別加0.5、1.0、1.5 mol/L與2.0 mo1/L的NaCl溶液20 mL，在溫度為40 ℃條件下水浴浸提40 min。設定離心機轉子速度為3 000 r/min，時間為15 min，保留經離心處理所得上清液，沉淀棄去。

3.1.3 蛋白質浸提率受不同料液比例作用的變化情況

準確稱量粒度是60目的葡萄籽粉各1.000 g，放入50 mL離心管中，依次以固液比1∶10、1∶15、1∶20與1∶25加入1.0 mol/L NaCl溶液，在溫度為40 ℃的條件下水浴浸提40 min。設定離心機轉子速度為3 000 r/min，時間為15 min，保留經離心處理所得上清液，棄去沉淀。

3.1.4 蛋白質浸提率受不同溫度條件作用的變化情況

準確稱量粒度是60目的葡萄籽粉各1.000 g，放入50 mL離心管中，以料液比1∶20加1.0 mol/L NaCl溶液20 mL，分別在 30、35、40 ℃與45 ℃的溫度條件下水浴浸提40 min。設定離心機轉子速度為3 000 r/min，時間為15 min，保留經離心處理所得上清液，沉淀棄去。

3.1.5 蛋白質浸提率受不同浸提時間作用的變化情況

準確稱量粒徑是60目的葡萄籽粉各1.000 g，放入50 mL離心管中，以料液比1∶20加1.0 mol/L的NaCl溶液20 mL，在溫度為40 ℃的恒溫水浴箱中分別浸提30、40、50 min與60 min。設定離心機轉子速度為3 000 r/min，時間為15 min，保留經離心處理所得上清液，沉淀棄去。

3.2 正交試驗設計

以單因素試驗結果為依據，選取A（NaCl濃度 0.5、1.0、1.5 mol/L）、B(固液比1∶15、1∶20、1∶25)、C（溫度35、40、45 ℃）、D(提取時間30、40、50 min)這4個要素，每因素取3個水平，采用L9（34）正交實驗，分析確認鹽溶法提取葡萄籽蛋白的最佳參數。

4 葡萄籽蛋白質的檢測指標

4.1 葡萄籽蛋白質含量的檢測方法

依據國家標準（GB 5009.5—2016）檢測和計算葡萄籽中所含蛋白質總量。浸提液中所含蛋白的量利用考馬斯亮藍法進行檢測和計算[6]。同時以牛血清蛋白作為標液，將測得的吸光度值作為縱坐標、濃度作為橫坐標，制作標準曲線，如圖1。

圖1 牛血清蛋白標準曲線

蛋白質提取率計算公式：

4.2 葡萄籽蛋白質等電點（pI）檢測方法[7]

用3 mol/L HCl溶液調節提取后的蛋白溶液pH值分別至3.40、3.57、3.70、3.80、3.96、4.05和 4.13， 靜置30 min后，在3 500 r/min的轉速下離心處理10 min，取上層清液，并稀釋30倍，將紫外分光光度計波長設定在595 nm處，對提取后的溶液進行吸光度測定，其中吸光度值最低時的pH即為此蛋白的等電點（pI）。

5 結果與分析

5.1 葡萄籽中所含蛋白質總量

用自動凱氏定氮儀測出葡萄籽樣品1、2中所含蛋白質的總量分別為12.79%和14.15%。可能因兩種葡萄籽產地各異，導致所含總蛋白質不同。

5.2 葡萄籽蛋白質的等電點（pI）

兩種葡萄籽樣品提取蛋白后溶液在pH=3.8附近處其吸光度值最低，等電點環境下蛋白質分子呈兩性離子狀態，凈電荷總數為0，粒子間無電荷相斥作用，穩定性最差，溶解度也最小，因此該點為葡萄籽蛋白的等電點，即pI為3.8。所以，加入弱酸將蛋白質提取液pH調至等電點（pI），此時極易凝集析出蛋白質。此外，該試驗測得兩種樣品蛋白質等電點一致，表明其等電點與葡萄樣品品種無關。

5.3 NaCl溶液浸提法的單因素實驗分析

5.3.1 葡萄籽提取液中蛋白質含量隨目數大小的變化

分別測得樣品1、2不同粒度目數下的蛋白質提取液吸光度值，代入標曲得出蛋白質含量，并根據公式計算出提取率，見表1。

結果分析：60目時樣品1、2提取液中蛋白含量最高，此時蛋白提取率最大分別為61.93%、49.42%。

5.3.2 葡萄籽提取液中蛋白質含量隨NaCl濃度高低的變化

分別測得樣品1、2不同NaCl濃度的蛋白質提取液吸光度值，代入標曲得出蛋白質含量，計算出提取率，見表2。

結果分析：1.0 mol/L時樣品1、2提取液中蛋白含量最高，此時蛋白提取率最大分別為52.90%、48.88%。

5.3.3 葡萄籽提取液中蛋白質含量隨料液比大小的變化

分別測得樣品1、2不同料液比的蛋白質提取液吸光度值，代入標曲得出蛋白質含量，并計算出提取率，見表3。

結果分析：料液比為1∶20時樣品1、2提取液中蛋白含量最高，提取率最大分別為53.82%、48.60%。

5.3.4 葡萄籽提取液中蛋白質含量隨浸提溫度高低的變化

分別測得樣品1、2不同溫度條件下所得蛋白質提取液的吸光度值，代入標曲得出蛋白質含量，并計算出提取率，見表4。

結果分析：40 ℃時樣品1、2提取液中蛋白含量最高，此時蛋白提取率最高分別為60.70%、46.99%。

5.3.5 葡萄籽提取液中蛋白質含量隨浸提時間長短的變化

分別測得樣品1、2不同提取時長下所得蛋白質提取液的吸光度值，代入標曲得出蛋白質含量，并計算出提取率，見表5。

結果分析：40 min時樣品1、2提取液中蛋白含量最高，此時蛋白提取率最大分別為47.90%、44.05%。

5.4 NaCl浸提法提取蛋白質正交分析結果

以單因素試驗結果為基礎，經L9（34）的正交設計和實驗數據分析，以選擇確定NaCl溶液浸提法提取葡萄籽中所含蛋白的最佳參數，試驗材料選用葡萄籽樣品1（烏海）。

表6得知，4個因素中極差R最大的是C為15.470，其次是A為14.250，再次是B為12.093，最后是D為7.886，因此，葡萄籽樣品1的蛋白浸提量隨四因素變化的強弱程度為C＞A＞B＞D。

統計分析各因素實驗結果可得：利用NaCl溶液浸提法對葡萄籽中所含蛋白進行浸提的最適宜參數為A2B2C2D2，即以1.0 mol/L濃度的NaCl溶液，按1∶20的料液比，于溫度為40 ℃的水浴中提取40 min，所得蛋白質提取率最高64.46%。

表1 葡萄籽提取液中蛋白質含量隨粒度目數大小的變化

表2 葡萄籽提取液中蛋白質含量隨NaCl濃度高低的變化

表3 葡萄籽提取液中蛋白質含量隨料液比大小的變化

表4 葡萄籽提取液中蛋白質含量隨浸提溫度高低的變化

表5 葡萄籽提取液中蛋白質含量隨浸提時間長短的變化

表6 鹽法浸提葡萄籽中所含蛋白的正交數據結果

6 結論

選取兩種葡萄籽（烏海，銀川）為原料，對蛋白質的提取進行試驗和分析，最終得出以下結論。

蛋白質含量及等電點：葡萄籽樣品1、2所含蛋白質總量分別為12.79%和14.15%；葡萄籽蛋白質的等電點pI為3.8。

NaCl溶液浸提法對葡萄籽進行蛋白質提取的研究結果：該方法最優參數條件為粉碎粒度60目，料液比1∶20，NaCl濃度1.0 mol/L，提取溫度40 ℃，浸提時間40 min。在此條件下，葡萄籽樣品1、2提取蛋白最高率分別為64.46%、49.42%。鹽法正交實驗結果表明：NaCl溶液浸提法中不同因素條件變化對蛋白質浸提程度作用的強弱為溫度條件＞NaCl濃度＞料液比＞提取時間。