鹽酸克倫特羅、萊克多巴胺、沙丁胺醇檢驗方法的簡化與驗證

□ 李 洋 辛偉娟 史麗新 孫鈞儒 侯世松 朱希敏 煙臺喜旺肉類食品有限公司

“瘦肉精”是一種特定的可用來減少被飼養動物脂肪、增加其瘦肉比例的藥物的俗稱。傳統型瘦肉精一般是指β－受體激動劑，是一類人工合成的苯乙醇胺類物質，包括克倫特羅、沙丁胺醇、萊克多巴胺、特布他林、異丙喘寧、氯丙那林、西馬特羅與非諾特羅等，其中克倫特羅、沙丁胺醇、萊克多巴胺最為常見。該類藥物在動物性食品中的殘留會對消費者的身體造成不同程度的影響，對于易感人群危害更為嚴重[1—2]。2002年，β －受體激動劑被列入《食用動物禁用獸藥及其他化合物清單》[3]。

現階段，對β－受體激動劑和喹乙醇及其代謝物的檢測方法較多。劉佳等[4]建立了一種檢測豬肝中26種β2—受體激動劑藥物殘留的反相液相色譜—串聯質譜方法；金玉娥等[5]也采用液相色譜—串聯質譜測定了豬肉和豬肝中11種β2—受體激動劑，上述檢測方法取得了比較理想的結果。但上述研究的前處理過程都比較復雜，一般包括酶解、提取、固相萃取的過程，比較費時費力。

GB/T 21313—2007[6]的檢驗方法中用高氯酸溶液進行提取，眾所周知，高氯酸為強氧化易爆品，具有較高的危險性，在實驗室使用具有較大的安全隱患。本研究對GB/T 21313—2007的檢驗方法進行調整，用鹽酸溶液代替高氯酸溶液進行提取，簡化過柱凈化程序，提高實驗效率，降低上機液雜峰干擾。

1 材料與方法

1.1 試驗原理

試樣中β—受體激動劑殘留經酶解后，再用鹽酸溶液提取，經過濾和離心后，上清液用MCX固相萃取柱凈化，液相色譜/串聯質譜儀測定，外標峰面積法定量。

1.2 試驗儀器

液相色譜Agilent1200；二級串聯質譜Agilent6410；萬分之一分析天平；水浴鍋。

1.3 試劑

甲酸（99%）；乙腈，色譜純；甲醇，色譜純；乙酸，分析純，乙酸 鈉（NaAc·4H2O）； 鹽 酸 克 倫 特羅、萊克多巴胺、沙丁胺醇標準儲備液：準確稱取0.010 0 g標準品（色譜純≥99.5%），用甲醇溶解并定容至10 mL，即可得濃度為1 000 mg/L的標準儲備液，—18 ℃保存，有效期12個月。若購買的標準品為溶液，則直接稀釋為標準工作液。標準工作液：根據需要，用甲醇將標準儲備液配制成適當濃度的標準工作液。標準工作液應使用前配制。

2 驗證過程

2.1 試驗步驟

2.1.1 提取

準確稱取10 g樣品，加15 mL乙酸鈉緩沖液（0.2 mol/L，pH=5.2），渦旋后超聲10 min。再加入β—葡糖醛酸酐肽酶100 μL，于（37±1）℃震蕩酶解過夜。取出冷卻后，放入75 ℃水浴10 min，加入20 mL 0.2 M鹽酸，渦旋，超聲10 min，離心。

2.1.2 MCX柱凈化

MCX柱使用前用3 mL甲醇、3 mL水活化。取樣液過柱，棄去濾液，依次用3 mL水、2 mL甲醇淋洗，最后用3.5 mL 5%氨水甲醇溶液洗脫，洗脫液用氮氣吹干后，用5%乙腈水（0.1%甲酸）1 mL定容，渦旋，過0.22 μm濾膜，待測。

2.1.3 上機條件

2.1.3.1 液相色譜條件

色 譜 柱：SB—C18柱，2.1 mm×50 mm，1.8 μm；柱溫：40 ℃；流動相：A水（含0.1%甲酸）；B乙腈；流速：0.25 mL/min，梯度洗脫見表1。

表1 梯度洗脫表

2.1.3.2 監測離子對及能量

檢測過程中的質譜參數見表2。

表2 質譜參數

2.2 驗證參數

2.2.1 定性限

參 考 GB/T 21313—2007定 性 限0.1 μg/kg，以陰性樣品為測試樣品，鹽酸克倫特羅、萊克多巴胺、沙丁胺醇添加水平分別為0.1 μg/kg，在相同實驗條件下做3個平行樣，計算信噪比、離子豐度是否滿足要求。

保留時間：試樣中目標化合物色譜峰的保留時間與相應標準色譜峰的保留時間應一致，變化范圍應在±2.5%之內。信噪比：待測化合物的定性離子的重構離子色譜峰的信噪比應大于等于3（S/N≥3）。

定性時相對離子豐度的最大允許偏差見表3。

2.2.2 定量限

參 考 GB/T 21313—2007 定 性 限0.3 μg/kg，以陰性樣品為測試樣品，鹽酸克倫特羅、萊克多巴胺與沙丁胺醇添加水平分別為0.3 μg/kg，在相同實驗條件下做3個平行樣，計算信噪比、保留時間是否滿足要求。

表3 定性時相對離子豐度的最大允許偏差

保留時間：試樣中目標化合物色譜峰的保留時間與相應標準色譜峰的保留時間一致，變化范圍應在±2.5%之內。信噪比：待測化合物的定量離子的重構離子色譜峰的信噪比贏大于等于10（S/N≥10）。

2.2.3 回收率

以陰性樣品為測試樣品，鹽酸克倫特羅、萊克多巴胺、沙丁胺醇添加水平分別為0.3、0.6、1.0 μg/kg與3.0 μg/kg，每個水平在相同實驗條件下做6個平行樣，計算回收率、相對標準偏差。

2.2.4 精密度

以陰性樣品為測試樣品，鹽酸克倫特羅、萊克多巴胺、沙丁胺醇添加水平分別為0.3、0.6、1.0 μg/kg與3.0 μg/kg每個水平在相同實驗條件下做6個平行樣，計算實驗變異系數。

2.2.5 線性范圍

分別取 0.1、0.8、1.5、2.0 μg/L與3.0 μg/L的標準溶液進行測定，制作標準曲線。

3 結果與分析

3.1 定性限

按照試驗步驟，對陰性樣品進行加標，信噪比、相對離子豐度偏差如表4。

3個平行樣的保留時間、信噪比、相對離子豐度均滿足要求，能達到要求的定性限。

3.2 定量限

按照試驗步驟，對陰性樣品進行加標，信噪比、相對離子豐度偏差如表5。

表4 定性限相關參數

表5 定性限相關參數

3個平行樣的保留時間、信噪比、相對離子豐度均滿足要求，能達到要求的定性限要求。

3.3 回收率

按照實驗要求，對3個項目進行了4個水平的添加回收，具體數據見表6～8。

4個添加水平的回收率均能滿足GB/T 27404—2008中 的 被 測 組分含量＜0.1 mg/kg時回收率在60%～120%要求。

3.4 精密度

對不同添加水平的樣品在相同實驗條件下做6個平行樣，計算變異系數。具體數據見表9～11。

表6 沙丁胺醇回收率

表7 萊克多巴胺回收率

表8 鹽酸克倫特羅回收率

表9 沙丁胺醇精密度相關數據

表10 萊克多巴胺精密度相關數據

表11 鹽酸克倫特羅精密度相關數據

所添加水平的結果符合GB/T 27404—2008 中規定的 10 μg/kg 以下變異系數小于21%的要求。

3.5 線性范圍

分別取 0.1、0.8、1.5、2.0 μg/L與3.0 μg/L的標準溶液，制作標準曲線，見圖1～3，相關系數R2均大于0.999，鹽酸克倫特羅、萊克多巴胺、沙丁胺醇的濃度在0.1～3.0 μg/L的范圍內與響應值呈線性關系。

圖1 沙丁胺醇標準曲線

圖2 萊克多巴胺標準曲線

圖3 鹽酸克倫特羅標準曲線

4 結論

經過上述參數驗證，本研究所采用的檢測方法，符合GB/T 21313—2007、GB/T 27404—2018的要求，可以用于動物源性食品中鹽酸克倫特羅、萊克多巴胺、沙丁胺醇的檢測。本方法安全性高，操作快捷簡單，靈敏度較高，重復性好，能夠用于應急檢測或日常豬肉中克倫特羅、沙丁胺醇、萊克多巴胺殘留的監測，也為動物源食品中不同性質的獸藥殘留的高通量快速分析檢測提供了一定的技術參考[7]。