坎地沙坦與卡托普利對1型糖尿病小鼠主動脈活性氧水平的影響

劉 暢，張正浩，許世清

（中日友好醫(yī)院 臨床醫(yī)學(xué)研究所，北京 100029）

糖尿病（diabetes mellitus，DM）大血管病變的基礎(chǔ)是動脈粥樣硬化，其發(fā)生機制目前國內(nèi)外的共識認(rèn)為，主要包括內(nèi)皮型一氧化氮合酶（endothelial nitric oxide synthase，eNOS） 解偶聯(lián)所引起的血管內(nèi)一氧化氮（nitric oxide，NO）減少和超氧化物的含量增多而繼發(fā)血管內(nèi)皮功能障礙[1，2]。目前，臨床上廣泛應(yīng)用的DM 降壓藥物包括血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制劑（angiotension-converting enzyme inhibitor，ACEI） 或血管緊張素受體拮抗劑（angiotension Ⅱreceptor antagonist，ARB）。關(guān)于卡托普利與坎地沙坦是否能夠減輕DM 大血管氧化應(yīng)激水平，以及對eNOS 功能障礙的影響國內(nèi)外尚未見相關(guān)深入報道。本研究旨在評估卡托普利與坎地沙坦對鏈脲佐菌素（streptozotocin，STZ）誘導(dǎo)的Ⅰ型DM 小鼠主動脈氧化應(yīng)激水平以及eNOS 解偶聯(lián)的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

雄性C57BL/6J 小鼠，5～6 周齡 （北京華阜康生物科技股份有限公司），實驗動物飼養(yǎng)于中日友好醫(yī)院臨床醫(yī)學(xué)研究所醫(yī)學(xué)實驗動物平臺，室溫保持在25±1 ℃，濕度保持在55%±5%。動物自由攝食，自由飲水，保持規(guī)律的12h 晝夜循環(huán)。開始實驗前，動物正常飲食飲水，適應(yīng)性飼養(yǎng)1 周。

1.2 試劑與儀器

One-Touch I 穩(wěn)豪倍易血糖儀及試紙美國（Johnson & Johnson），超氧化物陰離子熒光探針DHE（Sigma，美國），L-NAME（Cayman，美國），坎地沙坦（上海源葉生物），卡托普利（Sigma，美國），Krebs-Henseleit（K-H）溶液（mmol/L）：NaCl 119，NaHCO325，MgCl21.19，KCl 4.7，KH2PO41.2，Ca-Cl2 2.5，D-Glucose 11.1。激光共聚焦掃描顯微鏡（Nikon，日本）。

1.3 標(biāo)本取材

小鼠灌胃給藥3d 后，戊巴比妥麻醉，注入4℃預(yù)冷的生理鹽水反復(fù)灌洗主動脈，取主動脈，在顯微鏡下小心去除周圍脂肪組織，截取3mm 的血管環(huán)，OCT 包埋劑包埋后用冰凍切片機切片，切片厚度10μm。

1.4 實驗設(shè)計與分組

健康小鼠30 只，隨機分成正常對照組（NC）和模型組。NC 組4 只，模型組26 只。小鼠禁食12h，但隨意飲水，然后以100ml/kg 的劑量連續(xù)3d向小鼠腹膜內(nèi)注射STZ 溶液（濃度12mg/ml）[3]。注射時將STZ 粉末溶于pH 4.5 的冰冷的0.1mol/L檸檬酸鹽緩沖液中，避光冰上配置。注射STZ 后72h，血糖可穩(wěn)定升高，以隨機血糖≥16.7mmol/L作為1 型DM 建模成功的標(biāo)準(zhǔn)。成模小鼠共26只，隨機分為3 組。DM 對照組（DM）：每天用生理鹽水灌胃1 次； 坎地沙坦干預(yù)組 （DM+CAD）：100mg/kg/d 藥物灌胃3d；卡托普利干預(yù)組（DM+CAP）：100mg/kg/d 藥物灌胃3d。小鼠分籠飼養(yǎng)，自由飲水，普通飼料喂養(yǎng)。

1.5 血糖測定

測定血糖時進(jìn)行尾靜脈取血，滴在血糖試紙上，利用血糖儀測定血糖水平。

1.6 超氧化物陰離子熒光探針（dihydroethidium，DHE）法檢測O2-水平

將冰凍切片于室溫下晾干，用PBS 沖洗切片5min 后甩干液體。一部分切片加入eNOS 抑制劑（nitro -L -arginine methyl ester，L -NAME）7μm 37℃條件下在避光預(yù)孵育30min，預(yù)孵育結(jié)束后將所有切片加入DHE （2μm），37℃條件下避光孵育30min，用蒸餾水沖洗切片1min，重復(fù)3 次。在激光共聚焦顯微鏡下觀察熒光，每個標(biāo)本選取3個高倍視野 （×400），相對熒光強度反映反應(yīng)性ROS 水平，相對熒光強度為處理組平均熒光強度相對未處理組的比值，平均熒光強度為同組多個熒光強度的均數(shù)。正常組和DM 組的處理和成像使用相同參數(shù)平行進(jìn)行，應(yīng)用Imagine J 軟件進(jìn)行圖像分析。

圖1 正常對照組與模型組小鼠主動脈超氧陰離子（）水平

圖2 加入L-NAME后各組別小鼠主動脈超氧陰離子（）水平

圖3 不同組別主動脈相對熒光強度的變化

1.7 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 實驗動物一般情況

正常組小鼠精神狀況良好、反應(yīng)靈敏、毛色光亮、進(jìn)食水及尿量正常，體重穩(wěn)定增長；DM 造模組小鼠則出現(xiàn)精神萎靡、反應(yīng)遲鈍、多飲、多食、多尿及體重下降等典型特征。實驗結(jié)束時造模組小鼠體重略低于對照組，但實驗前后動物體重在四組間均無顯著差異。

2.2 注射STZ 后小鼠血糖的變化

NC 組 小鼠血 糖正 常；DM 組、DM+CAD 組、DM+CAP 組血糖明顯升高 （＞16.7mmol/L）。造模前，NC 組與模型組血糖均正常，差異無統(tǒng)計學(xué)意義。注射STZ 72h 后，與NC 組相比，模型組小鼠血糖明顯升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（9.53±0.67 vs 22.16±1.41，P<0.01）。

2.3 超氧陰離子（O2-）水平

各組小鼠主動脈中O2-檢測結(jié)果顯示，模型組的DHE 熒光信號顯著高于對照組 （圖1，見封二），證實STZ 誘導(dǎo)的1 型DM 小鼠主動脈內(nèi)活性氧（reactive oxygen species，ROS）含量增加，氧化應(yīng)激水平明顯增高（P<0.05，圖3）。而CAD 組、CAP 組小鼠主動脈中ROS 生成量明顯減少，主動脈紅色熒光強度明顯減弱（圖1，見封二）。對MFI的分析結(jié)果顯示，與DM 組比較，DM+CAD 組、DM+CAP 組小鼠主動脈組織中ROS 生成量均明顯減少（均P<0.05，圖3）。給予eNOS 阻斷劑LNAME 孵育后，與未孵育相比，NC 組小鼠熒光強度增高（圖2，見封二），分析結(jié)果有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05，圖3），DM 組小鼠熒光強度減弱（圖2，見封二），分析結(jié)果有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），而DM+CAD 組和DM+CAP 組熒光強度增高（圖2，見封二），可逆轉(zhuǎn)這一表型（P<0.05，圖3）。

3 討論

據(jù)估計，到2035年，2013年全球3.82 億人的DM 患病率將升至5.92 億[4]。DM 并發(fā)癥以慢性病較為常見，表現(xiàn)為大血管病變、 微血管器官病變等。大血管并發(fā)癥包括心血管疾病，比如冠心病、中風(fēng)以及外周血管疾病。據(jù)相關(guān)報道，DM 患者中超過75%的死亡是由心血管疾病引起的[5]。因此，抑制和減輕大血管并發(fā)癥已成為DM 治療中的主要挑戰(zhàn)。長期的高血糖狀態(tài)引起多系統(tǒng)代謝紊亂，導(dǎo)致大血管及微血管的病變，嚴(yán)重威脅患者身體健康。一氧化氮合酶與DM 主動脈損傷有著密切聯(lián)系。NOS 包括3 種亞型，神經(jīng)元型（nNOS），誘導(dǎo)型（iNOS），和內(nèi)皮型（eNOS）[6]。eNOS 在血管內(nèi)皮細(xì)胞中組成型表達(dá)，在正常生理狀態(tài)下產(chǎn)生的NO 能夠起到擴(kuò)張血管的作用。在DM 條件下，eNOS 功能障礙解離為單體，不能產(chǎn)生NO 而是產(chǎn)生大量O2-，O2-與NO 結(jié)合生成大量ONOO-，對血管內(nèi)皮細(xì)胞進(jìn)而產(chǎn)生細(xì)胞毒作用[7]。現(xiàn)普遍認(rèn)為，在DM 早期階段，高血糖狀態(tài)誘導(dǎo)腎小球高濾過和尿鈉排泄，激活了Ang Ⅱ的合成作為代償機制維持正常血壓[8]，由于DM 時血漿及組織中AngⅡ濃度升高，Ang Ⅱ通過與血管緊張素Ⅰ型受體（AT1-R）結(jié)合，激活NAD（P）H 氧化酶，促進(jìn)ROS的產(chǎn)生，進(jìn)而促進(jìn)氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)，損傷內(nèi)皮功能，引起血管慢性炎癥、纖維化、凋亡以及動脈硬化等病理改變，而ROS 水平升高又是造成eNOS 脫偶聯(lián)的主要原因[9]。激活的RAS 通過改變血流動力學(xué)，促進(jìn)主動脈平滑肌細(xì)胞增生，加重炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激等多種機制，進(jìn)而誘發(fā)動脈粥樣硬化。抑制RAS 的藥物作為常用降壓藥在臨床上廣泛使用，Ang Ⅱ拮抗劑包括ACEI 和ARB 類藥物。腎素作為激活的激素釋放，控制腎臟，鈉和體內(nèi)穩(wěn)態(tài)。腎上腺腎小球細(xì)胞響應(yīng)各種刺激（包括降低的腎臟灌注壓力，交感神經(jīng)激活和減少的黃斑部小管鈉傳遞）而產(chǎn)生腎上腺素。該酶級聯(lián)反應(yīng)從循環(huán)的（主要是肝臟的）血管緊張素原開始產(chǎn)生相對無活性的十肽血管緊張素Ⅰ（Ang Ⅰ），然后非特異性酶血管緊張素轉(zhuǎn)換酶（ACE）從AngⅠ轉(zhuǎn)變?yōu)锳ng Ⅱ。除了產(chǎn)生Ang Ⅱ，ACE 分別催化緩激肽的降解[10]。因此，用ACE 抑制劑（ACEI）藥物進(jìn)行的治療會導(dǎo)致緩激肽積聚并抑制Ang Ⅱ[11]。卡托普利是人工合成的非肽類血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制劑，通過作用于腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)，同時其分子基團(tuán)上的巰基還能夠有效地保護(hù)血管內(nèi)皮細(xì)胞，在降低心血管死亡率方面發(fā)揮了重要的作用。坎地沙坦是選擇性血管緊張素受體拮抗劑，是繼ACEI 后又一類作用于RAS 的降壓藥物，其阻斷RAS，抑制了Ang Ⅱ誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激，具有更加長效、平穩(wěn)等特點。Ang Ⅱ激活兩種類型的血管緊張素Ⅱ受體即ATR Ⅰ和ATR Ⅱ。ATR Ⅰ受體在血管，腦，心臟，腎臟，腎上腺和神經(jīng)中含量豐富，而ATR Ⅱ在胎兒中顯著表達(dá)，但在產(chǎn)后期間數(shù)量減少。ATR Ⅰ的激活會增加三磷酸肌醇和各種花生四烯酸代謝產(chǎn)物，并降低環(huán)狀單磷酸腺苷。這會導(dǎo)致血管平滑肌收縮引起的全身血管收縮，醛固酮增加，導(dǎo)致近端小管對鈉的重吸收增加。血管緊張素Ⅱ還促進(jìn)兒茶酚胺從腎上腺髓質(zhì)和神經(jīng)末梢的釋放，引起交感神經(jīng)系統(tǒng)亢進(jìn)。因此，拮抗ATRⅠ會導(dǎo)致心臟后負(fù)荷和預(yù)負(fù)荷的降低，ARB 的抗高血壓特性主要歸因于周圍血管阻力的降低[10]。

目前檢測超氧陰離子的方法包括化學(xué)發(fā)光法、 熒光分析法、 酶學(xué)分析法以及電子順磁共振（EPR）。DHE 可自由透過活細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，并被細(xì)胞內(nèi)的ROS 氧化，形成氧化乙啶，氧化乙啶可摻入染色體DNA 中，產(chǎn)生紅色熒光。根據(jù)活細(xì)胞中紅色熒光的產(chǎn)生，可以判斷細(xì)胞ROS 含量的多少和變化。DHE 在熒光分析法中具有特異性強，保存時間相對較長的優(yōu)點。

在這項研究中，我們建立了STZ 誘導(dǎo)的1型DM 小鼠模型，研究了坎地沙坦與卡托普利這2種藥物對小鼠主動脈的氧化應(yīng)激水平及eNOS 功能障礙的影響。通過測量有或沒有與L-NAME 一起孵育的DHE 的熒光水平來評估主動脈切片中eNOS 的解偶聯(lián)。結(jié)果顯示，1 型DM 成模小鼠主動脈出現(xiàn)氧化應(yīng)激，給予Ang Ⅱ拮抗劑坎地沙坦和卡托普利藥物干預(yù)后，顯著降低了eNOS 衍生的超氧化物產(chǎn)生，氧化應(yīng)激水平明顯下降。LNAME 孵育后，正常對照組小鼠的主動脈熒光水平增高，表明NO 與超氧陰離子相互作用的有效性降低。DM 組小鼠的主動脈氧化應(yīng)激水平降低，這表明eNOS 解偶聯(lián)是DM 小鼠主動脈內(nèi)皮中ROS 的來源。給予AngⅡ拮抗劑坎地沙坦和卡托普利藥物干預(yù)后，可逆轉(zhuǎn)這一表型。

本研究結(jié)果提示，Ang Ⅱ作用于eNOS 解偶聯(lián)可能揭示了血管疾病中eNOS 功能障礙的常見機制。坎地沙坦和卡托普利通過改善eNOS 功能可能對于1 型DM 大血管病變的發(fā)生發(fā)展有一定延緩作用，能夠顯著降低主動脈氧化應(yīng)激水平，對大血管并發(fā)癥有一定的預(yù)防作用。