浮游態白念珠菌SC5314標準株及耐藥株自噬的研究

孫凱瑞，姜劉鎏，周 鵬，顧靜怡，徐 瑞，魏 昕

白念珠菌是一種常見的條件致病菌，在50%以上健康人的胃腸道、皮膚和黏膜上均有分布[1]。通常情況下，白念珠菌定植在健康個體中并不會引起疾病，然而，當宿主的防御功能被破壞時，白念珠菌會轉化為病原體入侵組織[2]。隨著抗真菌藥物的廣泛使用，白念珠菌耐藥性增加[3]。白念珠菌耐藥機制主要有：通過激活藥物外排泵來減少細胞內藥物的積累[4]，旁路途徑的產生[5]，以及藥物靶基因的突變[6-7]等。然而，Alizadeh[8]研究耐藥基因時發現與對照組相比，耐藥基因在氟康唑耐藥株并沒有顯著變化；Sardari[9]在氟康唑耐藥株中分離出的41個突變的密碼子中，只有4個引起了藥物靶基因的變化，而且這些突變并不會導致氟康唑耐藥。上述研究表明，白念珠菌耐藥可能還存在其他機制。

自噬是真核生物中一種高度保守的細胞過程[10]，通過細胞外應激(營養缺乏或是壓力)和細胞內應激(清除受損細胞器或蛋白質的積累)，降解非必需或功能失調的細胞內成分，如異常蛋白、衰老的細胞器和病原體，來調節和維持細胞內外環境的穩定[11]。自噬有3種類型：伴侶介導的自噬、微自噬和巨自噬[12]。巨自噬(也是通常所稱的自噬)是最典型的自噬[13]，即本文所研究的自噬。

耐藥和自噬之間的關系，在腫瘤[14-15]、糖尿病[16]和白血病[17]等疾病中研究較多。在抗癌藥物與自噬的相關研究中發現，耐藥的腫瘤細胞中普遍存在自噬改變[14]。Liu[15]研究藥物調節腫瘤細胞自噬時發現，替康唑可阻礙腫瘤細胞自噬相關蛋白Atg4的活性位點，同時可積累自噬小體降低細胞內自噬通量，并且可以減弱腫瘤細胞活力使其對化療藥物敏感，降低耐藥。另外，研究表明抑制自噬和化療協同作用可觸發腫瘤細胞死亡，改善癌癥治療效果[18]。這提示自噬在藥物敏感性及耐藥中的作用十分重要，自噬激活或增強可能增加抗癌藥物耐藥，促進癌癥細胞的生長。在白念珠菌的研究中，Yu[19]發現抗真菌藥物治療引起的內質網應激可能會激活自噬，從而抵抗藥物壓力并介導細胞存活。本課題組在前期預實驗中發現，自噬相關基因在氟康唑誘導構建的白念珠菌耐藥株和標準株中有著顯著的差異。

本研究旨在探索浮游狀態白念珠菌耐藥株與標準株自噬的差異，初步探討自噬在白念珠菌耐藥中的作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗菌株 白念珠菌標準株(SC5314)，購自美國模式培養物集存庫(ATCC)；白念珠菌耐藥株由本實驗室誘導構建。KONT真菌顯色MIC藥敏系統穩定性檢測試驗條鑒定耐藥株[20]，MIC≥64 μg/mL。

1.1.2 主要試劑 沙堡瓊脂培養基(SDA，6.3 g/100 mL)，YPD培養液(2%葡萄糖，2%胰蛋白胨，1%酵母提取物), RPMI 1640培養基(GIBCO公司,美國)，氟康唑(Sigma公司，美國)，XTT工作液(1 μmol/L，Sigma公司，美國)，BCA試劑盒(BCA Protein Assay Kit BioWorld，美國)；堿性磷酸酶試劑盒(碧云天，中國)；雷帕霉素(Rapamycin，Sigma公司，美國)；4%戊二醛固定液(Sigma公司，美國)等。

1.2 實驗方法

1.2.1 浮游狀態白念珠菌標準株及耐藥株獲得 取-70 ℃保種的白念珠菌標準株SC5314及耐藥株分別接種到SDA培養基中，5% CO2，37 ℃培養24 h。分別取單克隆菌株于YPD培養基中，30 ℃，200 r/min搖床過夜生長16～18 h，達到對數生長期。

1.2.2 實時熒光定量PCR(quantitative real-time PCR)RT-qPCR檢測自噬相關基因表達 改良熱酚法[21]提取培養24 h的浮游狀白念珠菌標準株及耐藥株總RNA，逆轉成cDNA，-20 ℃保存。

RT-qPCR采用iTaq-SYBR Green 預混酶和ABI 7900進行檢測，10 μL反應體系：cDNA(0.05 μL)，基因上下游引物(各0.3 μL)(18rS為內參基因，F和R分別是各基因內一對正反向引物)，SYBR green master mix(5 μL)，反應條件為：95 ℃ 30 s，95 ℃ 10 s，60 ℃ 30 s，40個循環；70 ℃ 20 s；最后4 ℃冷卻。記錄相應的Ct值。消除組間的加樣量誤差，重復3次。ΔΔCt目標基因=處理組ΔCt目標基因-對照組ΔCt目標基因，基因相對表達量采用2-ΔΔCt方法計算(引物序列見表1)。

表1 引物序列

1.2.3 堿性磷酸酶(ALP)活性檢測自噬表達 收集24 h的浮游狀白念珠菌標準株和耐藥株細胞，BCA法測定蛋白濃度；按ALP試劑盒說明準備工作液，并進行加樣，充分混勻，37 ℃靜置孵育40 min，于每孔中依次加入100 μL反應終止液，多功能酶標儀處測OD405。根據繪制的標準曲線及測定的蛋白濃度計算對應的堿性磷酸酶活性。堿性磷酸酶(U/gprot)=(測定孔OD值-空白孔OD值)÷(標準孔OD值-空白孔OD值)×酚標準品濃度÷待測樣本蛋白濃度。

1.2.4 透射電子顯微鏡觀察自噬現象 收集24 h的白念珠菌標準株及耐藥株細胞，PBS洗滌2次，離心收集；4%戊二醛4 ℃固定2 h后送樣，透射電鏡下觀察自噬現象。

1.3 統計學方法

實驗數據使用SPSS 23.0軟件進行分析。采用t檢驗、單因素方差分析，P<0.05則認為差異具有統計學意義。

2 結 果

2.1 RT-qPCR檢測自噬相關基因表達結果

白念珠菌耐藥株與標準株相比，自噬相關基因Atg5、Atg8、Atg13和Ccz1表達上調，具有統計學意義(圖1，P<0.05)，而Atg1和Atg9表達雖呈上調趨勢，但無統計學意義。

基因表達倍數變化與對照組(白念珠菌標準株)結果相關。采用18rS rRNA對表達數據進行歸一化處理。數據為三個獨立實驗的平均值±標準差;*：P<0.05

2.2 ALP活性檢測結果

與白念珠菌標準株相比，耐藥株ALP活性水平上調(P<0.05)(圖2)，提示自噬水平高。

數據為3個獨立實驗的平均值±標準差;*：P<0.05

2.3 透射電子顯微鏡觀察自噬小體形態

在標準株中，未觀察到自噬小體的形成(圖3 A1～A3、C1～C3)；而在耐藥株中，可以觀察到自噬小體(圖3 B1～B3、D1～D3)。

A1～A3: 標準株,B1～B3:耐藥株( ×8 000； AP：自噬小體；N：細胞核);C1～C3: 標準株；D1～D3:耐藥株( ×30 000；AP：自噬小體；N：細胞核)

3 討 論

迄今為止，在釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)中已經發現了超過40個自噬相關(autophagy-related, ATG)基因，其中大多數在更復雜的真核生物中具有同源性[22]。在白念珠菌中，自噬相關基因Atg1、Atg8、Atg9和Ccz1等被鑒定出來[11,19,23-24]。研究表明，白念珠菌通過增高自噬相關基因(Atg9、Atg2和Lap41) 的表達，改變細胞內自噬流(autophagic flux)，引發自噬現象，從而減輕內質網的壓力，保持內質網壓力的平衡，以維護自身生存[19]。在釀酒酵母自噬研究中發現，雷帕霉素靶(target of rapamycin, TOR) 在自噬調控中起主導作用，直接參與自噬的各個階段，其中TOR1信號通路通過與其直接底物自噬蛋白Atg13(autophagy-related proteins 13，Atg13)或Atg1能量傳遞而構成自噬調節的主軸，Atg1或Atg13磷酸化可逆向調控TOR1，但其間分子信號傳遞的詳細機制還有待闡明[25]。本研究中，白念珠菌耐藥株與標準株相比，自噬相關基因Atg5、Atg8、Atg13和Ccz1表達顯著上調。而Yu[19]研究在野生型菌株中，盡管氟康唑略微上調了Atg1的表達，但對Atg5和Atg8的表達均無顯著影響。這似乎與本實驗耐藥株自噬相關基因Atg5和Atg8的表達同標準株相比顯著上調有所不同。但是本研究主要研究的對象是構建誘導形成的穩定狀態的氟康唑耐藥菌株，而Yu[19]研究白念珠菌是通過1.5 μg/mL氟康唑臨時處理白念珠菌野生株數小時對其進行刺激。這或許可以提示白念珠菌耐藥狀態的不同，會導致自噬相關基因的表達產生差異。在腫瘤細胞研究中發現，自噬是維持腫瘤細胞生長所必須的，在刪除必要的自噬相關基因后，腫瘤細胞生長受到一定的抑制，表明尋找必要自噬相關基因有助于靶向治療腫瘤[26]。本實驗白念珠菌自噬相關基因的研究，有利于尋找和研究白念珠菌標準株和耐藥株必要的自噬相關基因，對靶向治療白念珠菌以及解決白念珠菌耐藥問題具有一定的意義。

在酵母中，ALP在內質網中作為非活性前體合成，處于非活性狀態，并通過分泌途徑轉運到液泡中[27]。一旦到達液泡，C′末端的前導肽區就會被液泡蛋白酶裂解，導致酶的活性形成[28]。當自噬發生時，ALP前體隨機被自噬體吞噬，導致其轉運至液泡并被激活。ALP前體通過自噬的方式被降解成有活性的酶，因此通過檢測ALP活性來監測自噬發生的水平[29]。本研究ALP活性檢測結果顯示，耐藥株和標準株相比，ALP活性顯著增加，提示在耐藥株中，自噬水平升高，這進一步說明了自噬對耐藥株和標準株調節存在著差異，即自噬可能對白念珠菌耐藥存在影響。在癌癥、感染和炎性疾病的研究中發現，自噬功能障礙與上述多種疾病相關，它既是發病機制的調節因子，也是潛在的治療靶點。例如，抑制自噬會導致腫瘤細胞生長受到抑制[26]；在對金黃色葡萄球菌等細菌的研究中發現，細菌可以主動誘導自噬，利用自噬成分進行細胞內復制，阻斷細胞凋亡，促進持續性感染[30]。這些研究表明自噬增強在許多情況下起到調節和促進細胞生長的作用。ALP實驗的優點是：可以清晰地定量讀數，還可以測量非選擇性自噬途徑的通量自噬，因為在選擇性自噬中，隔離膜特異性地包繞被容物，不會包括其他細胞質物質。然而，ALP實驗存在背景信號的干擾，使得檢測低水平細胞自噬變得困難[31]。所以通常需要結合其他檢測結果。

本實驗透射電鏡觀察，標準株中除了細胞器幾乎沒有自噬小體，而在耐藥株中，盡管不多，但仍然可以看到。透射電鏡的結果從形態學上提示耐藥株和標準株之間自噬存在著差異，更進一步說明自噬對耐藥可能存在影響。透射電鏡是觀察自噬小體的金標準，但是不便于動態監測自噬[32]。通常用于自噬流監測的方法是熒光標記物綠色熒光蛋白(green fluorescent protein, GFP)來標記自噬相關蛋白如Atg8等[33]。

綜上所述，浮游狀態白念珠菌耐藥株和標準株之間的自噬存在差異，提示白念珠菌耐藥性的產生，可能存在自噬的調節作用。而自噬在白念珠菌耐藥的具體作用和機制還需進一步研究。