肝細胞生長因子對成骨細胞增殖、凋亡及成骨分化的影響

李若涵，佘文婷，華 超，駱 瑜，黃 麗，彭友儉

外傷、腫瘤、炎癥等可能會導致大面積的骨組織缺損，為臨床修復帶來巨大挑戰，缺損的組織修復成為了亟待解決的難題[1]。目前臨床常用的傳統骨修復方法效果通常不甚理想，常規治療后仍有5%～10%的患者骨缺損不能正常愈合[2]。近年來，干細胞移植和生長因子改性的骨修復材料的出現在極大程度上解決了骨組織再生效果不良的問題。但骨修復材料的研究與應用目前尚處于起步階段，仍需要開展大量相關的基礎研究，為生物材料的研發奠定基礎。

肝細胞生長因子(hepatocyte growth factor, HGF)作為能刺激肝細胞增殖的物質被發現，是一種來源于間葉組織的細胞外信號分子，由間充質細胞分泌，參與上皮-間充質相互作用[3]。HGF具有強大的促有絲分裂效應，通過自分泌和旁分泌作用促進肝臟、心臟和肌肉的營養吸收和利用，并促進組織修復[4-6]。骨的愈合過程(包括血管形成、炎癥抑制和間充質細胞進入等)由細胞外信號分子介導[7]。血小板衍生生長因子、成纖維細胞生長因子和血管內皮生長因子等多種細胞外信號分子均可以促進骨折愈合和骨再生[8]。然而，HGF在骨組織生長發育過程中的調控作用尚未探明。因此，本研究擬通過在小鼠成骨細胞前體細胞系(MC3T3-E1)中外源加入HGF以探索HGF對MC3T3-E1細胞增殖、凋亡以及成骨分化和礦化能力的影響，旨在為HGF在骨組織工程領域的應用提供理論依據，并為新型骨生物材料的研發提供新思路。

1 材料與方法

1.1 主要試劑和儀器

CO2培養箱(Thermo,美國)；離心機(Eppendorf,德國)；PCR儀(Biorad,美國)；HGF(Peprotech，美國)；細胞計數試劑盒(cell counting kit-8, CCK-8)(Dojindo,日本)；TUNEL細胞凋亡檢測試劑盒(碧云天，上海)；逆轉錄試劑盒，RT-PCR試劑盒(Takara，日本)；堿性磷酸酶(alkaline phosphatase， ALP)、骨鈣素(osteocalcin，OCN)、Runt相關轉錄因子(Runt-related transcription factor 2，Runx2)、成骨細胞特異性轉錄因子(osterix，OSX)和甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase， GAPDH)抗體(ABCAM，美國)。

1.2 實驗方法

1.2.1 細胞培養 將MC3T3-E1細胞培養于含10%胎牛血清的DMEM高糖培養基中，置于37 ℃、5% CO2的細胞培養箱內常規培養，2 d換液，3～4 d傳代，待細胞進入對數生長期后進行實驗。

1.2.2 CCK-8法檢測 將MC3T3-E1細胞分為3組，每組設置5個復孔。對照組加入生理鹽水，其他兩組加入HGF溶液至終濃度分別為10 ng/mL、25 ng/mL。培養24 h、48 h、72 h后在避光處加入配制好的CCK-8液，37 ℃孵育2 h，450 nm檢測其OD值。

1.2.3 TUNEL法檢測 細胞分組及處理如上。培養24 h、48 h、72 h后，加入0.3% Triton X-100的PBS,室溫孵育5 min。加入50 μL TUNEL檢測液，37 ℃避光孵育60 min。用抗熒光淬滅液封片，在熒光顯微鏡下觀察。隨機選取5個視野，以凋亡細胞數與總細胞數的比值作為細胞的凋亡率。

1.2.4 堿性磷酸酶(ALP)和茜素紅染色 將MC3T3-E1細胞分為對照組和實驗組(HGF：25 ng/mL)，成骨誘導培養基(含10 mmol/L β-甘油磷酸鈉、10 nmol/L地塞米松、0.2 mmol/L維生素C)培養7 d后，按照說明進行ALP染色；成骨誘導14 d后，4%多聚甲醛固定1 h,現配的1%茜素紅染液孵育30 min，自然干燥，觀察拍照。

1.2.5 PCR檢測 對照組和實驗組的細胞在成骨誘導7 d后，Trizol法提取總RNA。按照說明書將mRNA反轉錄為cDNA，反應條件為：42 ℃，15 min，共3個循環，85 ℃，5 s。應用RT-PCR試劑盒檢測成骨相關基因的mRNA水平，包括ALP、Runx2、OCN、OSX，引物序列見表1。PCR反應條件：預變性：95 ℃，2 min；PCR反應：95 ℃變性15 s，60 ℃退火+延伸60 s，共40個循環；繪制熔解曲線：95 ℃，5 s。以GAPDH為內參，使用2-ΔΔCt法計算相對表達量。

表1 實時熒光定量聚合酶鏈反應目的基因的引物序列

1.2.6 Western Blot檢測 對照組和實驗組的細胞在成骨誘導7 d后，加入RIPA裂解液冰上裂解30 min，離心后收集上清液。利用BCA法檢測蛋白濃度，并將相同量的蛋白加入PAGE凝膠進行電泳分離，濕轉膜至PVDF膜上，牛奶室溫封閉1 h，一抗4 ℃孵育過夜，二抗室溫搖床孵育2 h，底物化學發光ECL顯色，凝膠成像儀曝光后進行圖像分析。采用GAPDH作為內參，檢測ALP、Runx2、OCN、OSX的表達情況，每組重復3次。

1.3 統計學分析

2 結 果

2.1 HGF對MC3T3-E1細胞增殖能力的影響

培養24 h時，10 ng/mL和25 ng/mL的HGF組與對照組的OD值無統計學差異。培養48 h時，高濃度組的OD值較對照組明顯升高，提示細胞增殖能力的增強。培養72 h時，10 ng/mL組與25 ng/mL組的OD值與對照組比較差異具有顯著性(P<0.05)，說明10 ng/mL和25 ng/mL的HGF均明顯促進了成骨細胞的增殖(表2)。

表2 肝細胞生長因子對MC3T3-E1細胞增殖活性的影響(OD值)

2.2 HGF對MC3T3-E1細胞凋亡的影響

培養24 h和48 h時，10 ng/mL組細胞的凋亡率與對照組無統計學差異，而在72 h時，10 ng/mL組明顯低于對照組(7.67%vs. 10.05%，P<0.05)。25 ng/mL組細胞的凋亡率在24 h、48 h及72 h均低于對照組，差異具有統計學意義(P<0.05)(表3)。

表3 肝細胞生長因子對MC3T3-E1細胞凋亡率的影響

2.3 HGF對MC3T3-E1細胞礦化能力的影響

在對MC3T3-E1細胞進行成骨誘導7 d后，ALP染色可見細胞質呈紫色，實驗組的染色明顯深于對照組。細胞成骨誘導14 d后，茜素紅染色顯示紅色鈣結節形成，實驗組鈣結節的數量與顏色均高于對照組(圖1)。

A、C：對照組ALP和茜素紅染色結果；B、D：實驗組ALP和茜素紅染色結果

2.4 HGF對成骨相關因子mRNA和蛋白表達水平的影響

相較于對照組，實驗組細胞中成骨相關因子ALP、Runx2、OCN、OSX的mRNA表達水平顯著升高，相對表達量分別為1.78±0.17、3.49±0.26、1.60±0.04和1.82±0.17，以上差異較對照組均具有統計學意義(圖2)。Western Blot結果顯示，HGF也明顯促進了成骨相關因子ALP、Runx2、OCN、OSX的蛋白表達(圖3)。這些結果表明，HGF可促進MC3T3-E1細胞的成骨向分化。

與對照組比較，**：P<0.001

圖3 MC3T3-E1細胞成骨相關蛋白的表達水平

3 討 論

成骨細胞作為骨形成的主要功能細胞，參與骨基質的合成、分泌和礦化，從而調節骨形成和重建[9]。MC3T3-E1細胞具有高水平的成骨細胞分化特性，經誘導后形成礦化良好的細胞外基質，特異性表達成骨相關因子，可作為成骨細胞來進行研究[10]。因此，本研究應用MC3T3-E1細胞探究HGF對成骨細胞增殖、凋亡和成骨分化的影響。

HGF的生物學作用包括促有絲分裂、運動、形態發生和抗凋亡活性等，不僅作用于肝臟組織，也可作用于多種間葉來源的組織細胞[11-12]。本研究發現，HGF可以顯著促進MC3T3-E1細胞的增殖，也對細胞凋亡具有明顯的抑制作用，而且高濃度(25 ng/mL)的HGF相較于低濃度(10 ng/mL)作用更強。需要注意的是，HGF對破骨細胞和骨髓間充質干細胞同樣具有促生長的作用[13-15]。這意味著，HGF對于骨再生和重建都具有重要作用，可能在骨缺損愈合過程中能夠吸收愈合不良的異位骨痂，重建新生骨，從而維持良好骨穩態。因此，HGF在已發生不良愈合的骨再生環境中可能具有特異性的應用前景。

已有研究發現，骨髓瘤細胞可以合成HGF，并且HGF在多發骨髓瘤病人的骨髓中維持較高濃度[16]。鄭彥文等[17]發現了HGF可以趨化誘導骨髓間充質干細胞定向遷移，表明HGF在成骨分化過程中具有重要作用。在本研究中，ALP染色可見HGF處理后的MC3T3-E1細胞礦化結節染色陽性比例明顯升高，茜素紅染色也顯示出鈣結節數量的增加，表明了HGF對MC3T3-E1細胞礦化結節形成具有明顯的促進作用。

ALP作為反映成骨細胞分化和骨基質形成能力的標志物[18]，在實驗組中mRNA和蛋白表達水平顯著高于對照組，表明HGF促進了MC3T3-E1的早期分化。OCN是成骨細胞的特異性生化指標，只表達于硬組織中，能夠調節礦物質形成的速度和方向[19-20]。Runx2是成骨分化過程中重要的轉錄因子，是骨形成過程中最早和最具特征性的標志[21]。OSX是存在于Runx2下游的轉錄因子，僅在成骨細胞中特異性表達，主要在成骨分化晚期發揮作用[20]。通過對這些成骨相關因子的檢測，發現高濃度(25 ng/mL)的HGF可以顯著提高MC3T3-E1細胞中OCN、Runx2和OSX的mRNA和蛋白表達水平,與Wen等[22]對于骨髓間充質干細胞成骨分化的研究一致。成骨相關因子表達水平的升高意味著HGF促進了MC3T3-E1細胞的成骨分化，展現了HGF在骨組織再生領域的應用潛力。

綜上所述，HGF能夠促進體外培養的小鼠MC3T3-E1細胞的增殖，抑制其凋亡，并且能夠促進MC3T3-E1礦化誘導過程中成骨相關基因及蛋白的表達，提升細胞的成骨分化和礦化能力，在成為骨生物材料改性因子方面具有極大的潛力和發展前景。本研究為HGF在骨組織再生中的應用提供了重要的理論依據，為新型骨生物材料的研發提供了新的思路。