聯用大黃、黃芩對牙周炎SD大鼠炎性因子的抑制作用及對骨組織再生的促進效應研究

谷冬華，郭 寧，趙曉丹，劉 瑾，李 昂，茍建重

牙周炎可引起牙齦炎癥、牙槽骨吸收，最終導致牙齒的松動和脫落，是造成成年人牙齒喪失的主要原因[1]。而口腔內的細菌菌斑作為牙周炎發病的始動因子，可誘發早期的炎癥反應過程，宿主的防御反應會進一步促進牙周結締組織的破壞和牙槽骨吸收[2-3]。在防治牙周炎的藥物研究中，中藥以其不良反應小、多靶點受到關注；中藥配方以辨證為前提，致病機制為關鍵，藥物的藥理特性為基礎，遵循“君臣左使”的原則進行配伍，達到減毒增效的作用。大黃作為常用的寒下藥，適應證廣、療效明確、毒副作用小而被廣泛用于多種疾病的治療，已有研究發現大黃提取物可以通過影響炎癥因子的分泌和酶活性調整牙周組織免疫激活的后續環節[4],還可以抑制牙槽骨吸收[5]，促進骨髓基質干細胞的成骨分化[6]，從而達到抗菌消炎、促進骨質再生的藥理作用[7]。黃芩提取物可促進堿性磷酸酶產生，刺激細胞成骨轉化[8]；還可引起RANKL誘導的破骨細胞數量減少，炎性因子下降，從而使牙槽骨喪失減緩或停止，達到減輕牙周炎癥的效果[9]。

前列腺素E2(prostaglandin E2, PGE2)是花生四烯酸的代謝物，它是炎癥誘導骨吸收的關鍵調節劑。在牙周炎的病理發展過程中，PGE2可作為一種重要的炎癥介質參與其中：在炎性牙齦組織和齦溝液中，PGE2會顯著增加。同時，PGE2也是一種重要的刺激骨吸收的因子，研究表明牙周組織的破壞與高水平的PGE2密切相關[10]。Georgios等比較研究了齦上菌斑和齦下菌斑對人牙齦成纖維細胞產生PGE2的影響，其可以成為牙周局部組織破壞的誘導劑[11]，且PGE2的破骨效應與RANKL-OPG系統有關。

C反應蛋白(C-reactive protein, CRP)作為細菌感染和嚴重組織損傷的診斷指標之一，在一些急慢性炎癥性疾病(如風濕性關節炎等)、心肌梗死、組織損傷、感染及腫瘤等疾病中，其水平可有明顯升高；CRP還可作為手術感染及并發癥的指標，當術后CRP水平不降低或者再次升高時就提示有并發感染或血栓栓塞的可能；在大多數細菌性感染中，血清CRP的水平會升高，而多數病毒性感染則不升高，因此CRP還可作為兩者的鑒別診斷指標；CRP不僅是心血管疾病的警報器，在牙周炎患者中也觀察到有明顯的升高[12]。Maekawa等[13]通過實驗證實牙周局部感染引起CRP升高可能是牙周局部炎癥的致病機制之一，并且在一定的程度上，牙周局部的CRP還能潛在調節肝外CRP產生的系統性CRP水平。

本實驗在成功建立SD大鼠實驗性牙周炎動物模型的基礎上，采用局部注射單獨或者配伍的大黃、黃芩有效部位藥物，觀察對大鼠齦溝液、唾液及血液中PGE2和血液中CRP炎性因子含量的抑制作用及促進骨組織再生的影響，為進一步將大黃、黃芩聯用藥物用于臨床治療牙周炎提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 實驗藥物與試劑

大黃有效部位(質控指標成分大黃素含量30%)、黃芩有效部位(質控指標成分黃芩素含量80%)均購自陜西飛達生物有限公司，使用時用滅菌水配判成13 mg/L濃度的大黃有效部位和5 mg/L濃度的黃芩有效部位進行局部注射治療；戊巴比妥鈉(國藥集團化學試劑有限公司)；PGE2、C反應蛋白(C-reactive protein, CRP)的ELISA試劑盒(美國R&D公司)；超純水儀(Milipore,法國)。

1.2 實驗動物

100只3個月齡SD大鼠，清潔級，雄性，牙列完整，無齲壞及牙周病，體質量(170±10)g(由西安交通大學醫學部動物實驗中心提供)。所有大鼠均可自由飲水，分籠飼養，動物實驗經過西安交通大學口腔醫院倫理委員會審核并批準。

1.3 SD大鼠實驗性牙周炎動物模型的建立與分組

所有大鼠先適應性飼養1周，用復方新諾明混懸液(2%)代替日常飲水預處理1周，再換回正常飲水1周。按照體質量對等原則隨機分為5組：假手術組(Sham組)、牙周炎組(P組)、大黃有效部位組(DH)、黃芩有效部位組(HQ)和大黃、黃芩配伍藥組(DH+HQ)，每組20只。

假手術組僅在麻醉后在雙側上頜第二磨牙腭側牙齦溝底注射20 μL無菌PBS，并涂100 μL的PBS溶液建模；其余各組在雙側上頜第二磨牙腭側牙齦溝底注射牙齦卟啉單胞菌(Porphyromanusgingivalis,P.g, W83，購于首都醫科大學)菌液20 μL(2×1010CFU/mL)，并使用結扎絲線結扎牙頸部，然后于結扎絲線處涂抹100 μL菌液(1.5×109CFU/mL)。每隔2天重復1次，共4次。建模后8周，各組SD大鼠拆除結扎絲開始進行局部藥物治療。參照課題組前期實驗獲得的藥物有效濃度，采用13 mg/L濃度的大黃有效部位和5 mg/L濃度的黃芩有效部位單獨以及配伍進行局部注射處理；假手術組和牙周炎組給予局部注射等量生理鹽水，連續藥物治療4周。建模期間，所有大鼠均飼以軟食。

1.4 SD大鼠牙周組織病理形態學觀察

SD大鼠下頜骨病理形態學觀察，建模8周后取SD大鼠左側下頜骨磨牙段立即放入4%的多聚甲醛內固定48 h后取出，100 g/L EDTA脫鈣3周，常規石蠟包埋，沿下頜正中冠狀斷面切成5 μm厚的連續切片，HE染色后于光鏡下觀察、照相。

1.5 ELISA法檢測唾液、齦溝液和血液中的PGE2含量及血液中的CRP含量

各組大鼠連續局部藥物治療4周后，腹腔注射麻醉后，腹主動脈取血，3 500 r/min離心15 min，取血清；用濾紙條取大鼠口腔內唾液和雙側上頜第二磨牙頰舌側齦溝液，所有標本于-70 ℃保存。測定前將樣本和試劑盒取出，室溫下解凍30 min，用ELISA試劑盒檢測大鼠齦溝液、唾液及血清PGE2水平和血液CRP水平。具體操作步驟按照試劑盒說明書進行[14]。

1.6 SD大鼠骨組織形態計量學參數的測量

各組大鼠下頜骨磨牙段常規制片[15]，采用Micro CT對骨組織進行拍照，再利用Motic微機圖像處理系統進行骨組織形態學各參數的測量：在光鏡下采集下頜最后一個磨牙根部遠中松質骨圖像，依照等距隨機抽樣原則，同一標本選3張切片，每張切片選3個觀察視野。用MoticMed6.0數碼醫學圖像分析系統對上面所得圖像進行骨組織形態計量學相關參數測定[16]。

1.7 統計學方法

2 結 果

2.1 各組SD大鼠組織病理形態學觀察

建立大鼠牙周炎模型之后，采用不同的藥物進行治療4周，大鼠上頜第二磨牙組織病理學觀察可見：DH組大鼠牙槽骨可見有少量破骨細胞和骨吸收陷窩(圖1A)，HQ組可見有少量成骨細胞形成(圖1B)，DH+HQ配伍組成骨細胞比單獨的HQ組明顯增多(圖1C)，P組牙齦結合上皮與牙槽骨分離，牙槽嵴頂位于根中1/2，并且參差不齊，根分叉處有明顯的骨吸收區，破骨細胞及單核細胞增多(圖1D)；Sham組牙齦結合上皮底位于釉牙骨質界處，牙槽嵴頂和根分叉處牙槽骨形態和高度正常，未見破骨細胞及單核細胞(圖1E)。

A:DH組：牙槽骨可見有少量骨吸收陷窩和破骨細胞( ×40)；B:HQ組：可見有少量成骨細胞形成( ×40)；C:DH+HQ組：相對單獨HQ治療組有大量成骨細胞產生( ×40)；D:P組：牙齦結合上皮與牙槽骨分離，牙槽嵴頂位于根中1/2，并且參差不齊，根分叉處有明顯的骨吸收區，破骨細胞及單核細胞增多( ×4)；E:Sham組：牙齦位置，牙槽骨高度正常，未見牙槽骨吸收和炎性細胞( ×4)(均為藍色箭頭示)

2.2 各組SD大鼠齦溝液、唾液和血液中PGE2含量比較

SD大鼠經過不同分組的藥物進行局部治療4周后，利用ELISA試劑盒測定各組SD大鼠的PGE2含量，經過K-S檢驗提示符合正態分布，方差分析結果提示總體有差異(P<0.05)，兩兩比較結果顯示，牙周炎組(P組)大鼠齦溝液、唾液及血液中的PGE2水平顯著高于假手術組(Sham組)(P<0.05)，說明建立牙周炎模型后SD大鼠體內炎癥因子PGE2水平顯著上升；而經過大黃、黃芩有效部位單獨和配伍組局部用藥可明顯降低SD大鼠齦溝液、唾液以及血液中的PGE2水平：DH和HQ單獨用藥組的齦溝液、血液中PGE2含量仍然高于Sham組(P<0.05)，唾液中PGE2含量和Sham組無統計學差異；而DH+HQ配伍組的齦溝液、唾液和血液中PGE2含量和Sham組均無統計學差異；和P組比較：DH和HQ單獨組只有唾液中的PGE2含量顯著下降，齦溝液和血液中的PGE2含量無明顯差異；DH+HQ配伍組的齦溝液、唾液和血液中PGE2含量均明顯低于牙周炎組，并有統計學差異(P<0.05)(表1)。

表1 SD大鼠齦溝液、唾液和血液中的PGE2含量比較

2.3 各組SD大鼠血液中CRP含量比較

SD大鼠經過不同分組的藥物進行局部治療4周后，利用ELISA試劑盒測定各組SD大鼠血液中的CRP含量，結果經過K-S檢驗提示符合正態分布，經方差分析提示總體有差異(P<0.05)，LSD-t法組間兩兩比較結果顯示：相對于Sham組，P組大鼠血液中的CRP含量明顯升高，且有統計學意義(P<0.05)；藥物治療后雖然DH、HQ單獨和DH+HQ聯用組的CRP含量相較于P組均有所下降，但是只有DH+HQ聯用組的下降和P組比較具有統計學差異(P<0.05)；DH+HQ聯用組和Sham組無明顯差異，DH、HQ單獨藥物組和Sham組有明顯差異(表2)。

表2 SD大鼠血液中的CRP含量比較

2.4 SD大鼠形態計量學參數的比較

各組SD大鼠建模后再經過藥物治療4周后，上頜第二磨牙的Micro CT圖像如圖2所示:DH藥物治療4周可見根分叉有少量骨質再生(圖2A)；經HQ藥物治療組可見根分叉骨再生優于DH治療組(圖2B)；DH+HQ藥物聯用組的根分叉有大量骨再生，優于單獨用DH和HQ組(圖2C)；P組的根分叉只有極少量骨再生(圖2D)；Sham組的根分叉區骨質未見明顯吸收(圖2E)。骨組織形態學各參數經過K-S檢驗提示符合正態分布，經方差分析提示總體有差異(P<0.05)，LSD-t法組間兩兩比較結果顯示：相對于Sham組，P組大鼠的骨小梁各參數均有明顯下降，且有統計學意義(P<0.05)；藥物治療后僅DH+HQ聯用組的骨組織形態學各參數相比較P組有明顯差異(P<0.05)：相對骨體積(BV/TV)、骨表面積體積比(BSA/BV)、骨小梁厚度(Tb.Th)、骨小梁數目(Tb.N)比P組明顯升高，骨小梁間隙(Tb.Sp)和骨小梁模型因子(Tb.Pf)明顯降低；和假手術組均無明顯差異(表3)。

A:DH組：根分叉可見少量骨再生；B:HQ組：根分叉部分骨再生多于DH組；C:DH+HQ聯用組：根分叉大量骨再生，優于單獨使用DH和HQ組；D:P組：根分叉有極少量骨再生；E:Sham組：根分叉區骨質未見明顯吸收

表3 各組藥物局部治療4周后SD大鼠骨小梁參數比較

3 討 論

牙周病的細菌學研究證明，牙周病是由細菌感染所致，特別是革蘭陰性厭氧桿菌，如牙齦卟啉單胞菌、中間普氏菌和具核梭桿菌[17-18]。中藥藥理學研究發現，大黃的有效成分為蒽醌類衍生物(如大黃素、大黃酸、大黃酚等大部分與葡萄糖結合為苷的結合狀態)[19]，可以針對常見牙周致病菌發揮明顯抑菌作用，其作用機制可能是干擾厭氧菌細胞壁的形成；還可通過降低毛細血管通透性，調節機體免疫力，消除自由基和保護細胞功能，同時能夠顯著抑制內毒素激發的巨噬細胞內鈣離子升高，抑制前列腺素、白細胞介素的產生，從而抑制巨噬細胞脂類炎性介質活化過程，達到抑制炎癥介質發揮抗炎作用[20]。黃芩中可提取出黃芩素、黃芩苷等黃酮類的有效成分，具有促進牙周膜細胞增殖、增加細胞總蛋白和膠原含量，抗細胞粘附作用來保護細胞功能[21]，清除氧自由基、免疫調節和抗腫瘤等多方面的功能[22]；還可以通過降低牙周炎大鼠牙齦組織中腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor-α, TNF-α)、基質金屬蛋白酶9(matrix metalloproteinases 9, MMP-9)和白細胞介素6(interleukin 6, IL-6)的mRNA的表達含量[23]，聯用其他藥物抑制脂多糖、炎癥因子PGE2的合成，來改善大鼠牙周組織狀況[24]；同時黃芩水煎劑和水浸膏還可以有效抑制牙周可疑致病菌的生長，抑制牙槽骨吸收[25]。本實驗基于課題組前期實驗結果，采用不同濃度的大黃、黃芩有效部位對人牙周膜細胞增殖活性和產生炎性因子PGE2的影響，選擇13 mg/L濃度的大黃有效部位和5 mg/L濃度的黃芩有效部位單獨或者配伍治療SD大鼠實驗性牙周炎動物模型，觀察其組織病理學、炎性因子PGE2和CRP含量和牙槽骨再生的情況。

牙周炎的癥狀主要包括牙齦炎癥，牙周袋的形成，牙槽骨喪失及牙齒的松動甚至脫落。在本次研究中，假手術組(Sham組)牙槽骨未見骨質吸收和破骨細胞(圖1 E)；而通過結扎絲和細菌涂抹的方式建立實驗性牙周炎動物模型后，對建模后的牙周炎大鼠(P組)進行了組織病理學觀察，可見其牙齦溝底結合上皮與牙面分離，根分叉區可見到牙槽骨表面成排的破骨細胞形成，骨表面參差不齊(圖1 D)，證實本次實驗建立的模型符合牙周炎的要求；經過DH、HQ或者DH+HQ配伍藥物組治療后，可見不同組的大鼠牙槽骨出現不同數量的破骨細胞和成骨細胞，DH+HQ聯用組的成骨細胞形成最多，有更好的成骨效應(圖1 A,B,C)。

本實驗通過對SD大鼠齦溝液、唾液和血液中的PGE2含量進行統計分析，可見P組大鼠齦溝液、唾液及血液中的PGE2水平顯著高于Sham組(P<0.05)，說明建立牙周炎模型后SD大鼠體內炎癥因子PGE2水平顯著增加；而經過大黃、黃芩有效部位單獨和配伍組局部用藥后可明顯降低PGE2水平，且DH+HQ配伍組的齦溝液、唾液和血液中PGE2含量和Sham組均無統計學差異，而和P組比較齦溝液、唾液和血液中PGE2含量均明顯低于牙周炎組，并有統計學差異(P<0. 05)(見表1)，這說明大黃、黃芩藥物對實驗性牙周炎動物牙周組織產生PGE2有抑制作用，且配伍聯用組對牙周炎PGE2產生的抑制作用最明顯。通過分析血液中CRP的含量結果說明：牙周炎建模成功后P組大鼠的CRP含量明顯高于Sham組，說明其炎癥顯著，而經過不同組的藥物治療后雖然都比P組降低，但只有DH+HQ聯用組的下降與P組有統計學差異，說明聯用組消炎效果是優于單獨藥物組的。

Micro CT的主要應用領域之一是對骨骼的研究，尤其是骨小梁，近年來已經越來越多地應用于牙周骨組織再生的評估[26]。對骨的描述一般采用三維參數計量，其中相對骨體積(BV/TV)，骨表面積體積比(BSA/BV)，骨小梁厚度(Tb.Th)，骨小梁數目(Tb.N)這幾個參數的數值越大說明骨的健康狀況越好，骨小梁模型因子(Trabecular bone pattern factor, Tb.Pf)是1992年由Hahn等首次提出的，是一種以衡量骨小梁凸面和凹面程度來定量測量連通性的指標：先測量出結構的表面積(BS)和體積(BV)，然后利用膨脹將整體結構的體素增加一個單位的厚度，再次計算出骨小梁結構膨脹后的表面積(BS’)和體積(BV’)就可計算出Tb.Pf；它和骨小梁間隙(Tb.Sp)一起作為新的表示骨小梁連續性的參數，表示骨小梁柱狀梁和板狀梁的相互轉化：其值越小，表示骨小梁的連續性越好，提示骨小梁由桿狀向板狀發生變化[27]。通過表3的骨組織形態學參數的分析表明，大黃、黃芩配伍組的各參數均與牙周炎組有顯著的差異，且優于單獨的藥物組，進一步體現了藥物聯用后有更好的成骨作用。

綜上所述，采用結扎絲和細菌涂抹的方式可以成功建立SD大鼠實驗性牙周炎動物模型，而13 mg/L濃度的大黃有效部位和5 mg/L濃度的黃芩有效部位配伍后進行局部注射治療SD大鼠的實驗性牙周炎，可以明顯降低牙槽骨破骨細胞、增加成骨細胞數量，降低齦溝液、唾液以及血液中的PGE2含量和血液中的CRP含量，增加局部牙槽骨再生、調整骨組織形態學各參數水平，因此具有一定的改善牙周組織局部炎癥和促進局部骨組織再生的效果，但其具體的作用機制尚需后續實驗進一步深入探討。