負載生長因子引導骨再生屏障膜的研究進展

李嫻靜，儲順禮，熊成立，郝 爽，莫娟萍，張 煒，丁 典，鄭 云，王景云

1993年，Buser等[1]在Nyman等[2]提出的引導組織再生理論的基礎上開創了引導骨再生概念(guided bone regeneration, GBR)，即利用屏障膜的隔離作用阻止干擾骨形成的纖維結締組織進入骨缺損區，為骨缺損的愈合創造空間和條件，實現骨缺損區的修復性再生。GBR技術是現今臨床應用較為廣泛的骨增量手段之一[3]，其核心是屏障膜。發展至今，屏障膜經歷了材料和性能的不斷更替。第一代屏障膜為不可吸收膜，包括膨體聚四氟乙烯(expanded polytetra-fluoroethylene, e-PTFE)膜、鈦增強e-PTFE膜、聚四氟乙烯(polytetra-fluoroethylene，PTFE)膜和鈦網[4-5]，但其需要二次手術移除且膜暴露風險較高，故增加了繼發感染和干擾骨再生的風險[6-7]。第二代屏障膜為可吸收膜，包括天然和合成可吸收膜，如膠原膜、殼聚糖膜、聚乳酸(polylactic acid, PLA)膜和聚乙醇酸(polyglycolic acid, PGA)膜等[8]。這些膜由于良好的細胞相容性、生物相容性、低抗原性，彌補了第一代屏障膜的缺陷。然而不可避免的，可吸收膜也存在著諸如降解速度與成骨時間不匹配、機械性能不佳等缺點[9]，從而影響成骨效果。綜上，為提高骨再生效果，彌補上一代屏障膜的不足，第三代改性屏障膜成為現今的研究熱點。屏障膜的改性方法多種多樣，如搭載抗生素提高抗菌性[10]，加入骨替代材料促進成骨細胞生長[11]，引入成骨相關的生長因子提高骨再生的效果[12]，其中負載生長因子的屏障膜成骨誘導和成骨促進作用頗為突出，廣泛地出現在各類屏障膜改性的成骨研究中。本文將對屏障膜搭載生長因子的種類、負載方式、生長因子的釋放及其成骨效果進行綜述，對其前景進行剖析，為屏障膜的進一步改性提供方向。

1 促進骨再生的生長因子及其作用

生長因子是一種天然多肽，參與細胞的生長、增殖、遷移和分化，可與細胞表面的相應受體結合，激活不同的信號轉導途徑，誘導成骨相關蛋白的轉錄與表達[13]。骨再生的不同階段均需要生長因子參與調節，包括炎癥階段、血運重建與血管再生階段、肉芽組織形成階段、骨礦化與再吸收階段及骨改建階段[14]。已有大量研究使用骨缺損模型證實了骨形態發生蛋白[15](bone morphogenetic protein，BMP)、血管內皮生長因子[15](vascular endothelial growth factor，VEGF)、血小板衍生生長因子[16](platelet derived growth factor，PDGF)、成纖維細胞生長因子[17](fibroblast growth factor，FGF)、胰島素樣生長因子[18](insulin like growth factor，IGF)在促進骨再生方面的巨大潛力。以下，我們將重點介紹BMP、VEGF、PDGF-BB和FGF。

1.1 BMP

骨形態發生蛋白屬于轉化生長因子家族[19]，在骨形成與再生中發揮著重要的作用[20]。目前，已發現大約20種BMP，但并非全部都有成骨促進作用[21]。BPM-2是目前研究較廣泛，有可靠的成骨誘導作用的生長因子之一[22]。BMP-2參與骨再生的全部過程，在炎癥階段由脫顆粒的血小板及巨噬細胞釋放，作為促炎因子行使功能；在血管再生階段與VEGF協同促進血管生成；在肉芽組織生成階段，調節愈合級聯反應；在骨礦化與再吸收階段，由成骨細胞和骨細胞分泌并驅動骨形成；在骨重建階段，可誘導新骨的形成[23]。目前，使用重組DNA技術生產的人類重組BMP-2(rhBMP-2)已被廣泛地應用于骨缺損和組織缺損的治療中[24]。

1.2 VEGF

VEGF屬于同型二聚體蛋白家族，包括VEGF-A、VEGF-B、VEGF-C、VEGF-D、VEGF-E和胎盤生長因子(placental growth factor, PlGF)[25]。VEGF是骨再生進程血管再生階段的關鍵調節因子，可刺激內皮細胞增殖和遷移，促進骨形成細胞的募集[26]，從而協調血管再生和骨再生。研究證明給予外源性VEGF可增加骨缺損區內骨的礦化[27-28]。

1.3 PDGF

PDGF有多種亞型，包括AA、BB、AB、CC、DD，可通過結合兩種不同親和力的受體(α和β)而發揮作用。PDGF-BB由于其可與所有已知的同型受體結合而被認為是PDGF的代表[29]。PDGF具有促進細胞增殖、增加血管再生活性及調節細胞功能等特性，在骨再生進程中能夠增加間充質干細胞數量[30]，刺激其分化為成骨細胞[31]，從而促進新骨形成。

1.4 FGF

FGF家族至少由7個亞型，23種調節骨生長的蛋白質組成[32]。FGF參與骨再生中成骨細胞和成纖維細胞增殖與分化的調節[33]，協調血管生成，在骨祖細胞膜內信號轉導過程中有重要作用[34]。但FGF對骨再生的影響具有兩面性，高劑量FGF會抑制骨形成，低劑量可增加骨形成[35-36]。

2 負載方式

如前所述，大多數的生長因子具有可靠的成骨促進作用，然而由于其具有爆發釋放特性及在損傷區的快速清除特性，若無理想的呈遞載體將會帶來極大應用安全隱患及成本負擔[14]。許多合成或天然的生物材料，如膠原蛋白、聚乳酸聚乙二醇等被發現可作為呈遞生長因子的載體。故生長因子負載的屏障膜多選擇天然可吸收屏障膜和合成可吸收屏障膜，如膠原膜、殼聚糖膜、聚乳酸膜(PLA膜)、聚乙交酯膜(PGA膜)。目前主要的負載方式按操作方法分有三種，即浸泡孵育法、溶液凍干法及制膜液添加法；按結合方式分包括化學結合與物理包埋。其中化學結合雖比物理包埋提供更長時間的釋放，但由于蛋白質的偶聯可能導致活性官能團的損害而喪失生長因子的生物活性，目前多用于支架材料生長因子的負載[37]，屏障膜負載生長因子多采用物理包埋的方式。

2.1 浸泡孵育法

浸泡孵育法是將屏障膜浸泡在生長因子溶液中，經一定時間孵育，使生長因子吸附于膜上。目前孵育時間沒有明確規定，最短的為5 min，最長的可達24 h。Fujioka-Kobayashi等[38]將BMP-2和BMP-9與豬心包膠原膜(porcine pericardium collagen membranes，PPCM)和豬真皮衍生膠原膜(porcine dermis-derived collagen membranes，PDCM)浸泡并孵育5 min，負載量約達90%。Hong等[39]將FGF-2滴加到膜上并于室溫下孵育2 h，負載量約達50%。Lee等將肝素化的PCL/明膠復合纖維膜浸泡于FGF-2溶液中，室溫下孵育24 h，負載率最高約達58.6%。目前，關于孵育時間及孵育溶液濃度與負載至屏障膜的生長因子含量間的相關性尚無研究證據。

2.2 溶液凍干法

溶液凍干法是將屏障膜先浸泡于生長因子溶液中，隨后對其進行凍干操作，使生長因子負載于膜上。Du等[40]將bFGF和BMP-2溶液涂布于脫細胞真皮基質膜(acellular dermal matrix membrane，ADMM)4 ℃條件下過夜，隨后在-60 ℃凍干，成功將0.5 mL 200 ng/mL bFGF和800 ng/mL BMP-2負載至ADMM上。Mozgan等[41]將BioGide?膠原膜浸泡在富含生長因子的血小板制劑中并在-80 ℃條件下凍干，成功將多種生長因子負載于膠原膜上。

2.3 制膜液添加法

制膜液添加法是在屏障膜制作過程中將生長因子添加入制膜聚合物溶液中，隨后進行成膜操作，此后制備好的屏障膜即有生長因子負載。Lee等[42]將PDGF-BB水溶液按比例加入到左旋聚乳酸-磷酸三鈣(poly(L-lactic acid-tertiary)-calcium phosphate，PLLA-TCP)聚合物溶液中，混合均勻后澆鑄于模具上干燥成形，從而獲得負載生長因子的聚合膜。Ho等[43]將PDGF溶液添加入外消旋聚乳酸(poly-DL-lacide， PDLLA)溶液中，攪拌24 h后采用靜電紡絲技術在成品膠原膜表面形成負載有生長因子的納米纖維層功能面。

3 改性屏障膜生長因子的釋放

骨再生的過程歷時較長，生長因子參與調控其全部過程，但生長因子穩定性較低且體內半衰期較短，GBR膜作為生長因子的局部控釋系統[44],保證生長因子持續穩定的釋放是其改性的關鍵。大量的研究證實負載生長因子的屏障膜生長因子的釋放分為兩個階段，即爆發釋放期、平臺期。Takayama等[45]將膠原膜負載基質衍生因子-1(stromal cellderived factor-1， SDF-1)21 d內觀察其生長因子釋放量，在最初的1 d內即觀察到生長因子的爆發釋放，隨后進入平臺期，生長因子釋放濃度趨于平穩。Kim等[46]采用浸漬沉淀技術制備葉片堆疊結構膜(leaf-stacked structure membrane， LSS膜)，將該膜與Osteoguide?分別采用浸泡孵育法負載BMP-2，最終在成品膜組觀察到前6 d BMP-2的爆發釋放，占73%的負載量，而LSS膜組觀察到BMP-2的持續釋放無顯著爆發性釋放特征，38 d內釋放負載量的62%。這種差異可用材料表面的特殊結構對生長因子的再吸附來解釋。Khorsand等[47]將編碼BMP-2基因的納米復合物負載于膠原膜，通過觀察其在模擬體液中的釋放發現在最初的24 h大約65%～75%的納米復合物被釋放，并在隨后的4 d里持續緩慢釋放。Shim等[48]通過更長時間的觀察發現其采用3D打印方法制備的負載rhBPM-2復合材料屏障膜在最初的24 h經歷爆發釋放后，穩定的持續釋放期達28 d，能夠滿足更長時間的誘導成骨需求。

4 負載生長因子屏障膜的成骨療效

屏障膜負載生長因子的最終目的是獲得比單純應用屏障膜更可靠的骨再生效果，加快骨再生的速度。應用時負載生長因子對細胞的增殖、分化，骨形成相關蛋白的表達水平可靠的促進作用是評價其成骨療效的標準。Kim等[46]對負載BMP-2的屏障膜與人骨膜來源細胞共培養并進行堿性磷酸酶活性檢測、RUNX-2表達水平檢測、體內再生骨量的檢測，結果顯示負載生長因子的屏障膜各項指標均顯著優于單獨應用的屏障膜。Fujioka-Kobayashi等[38]對比負載BMP-2和rhBMP-9的膠原膜與單純應用膠原膜時小鼠基質細胞的成骨指標，負載生長因子的膜顯示出更強的細胞堿性磷酸酶活性，更高水平的骨鈣素表達，更高量的鈣化結節生成。現有的關于負載生長因子的屏障膜相關研究在細胞堿性磷酸酶活性、成骨相關蛋白表達水平及鈣化結節生成量上均顯著高于單純應用屏障膜，這提示了屏障膜作為生長因子載體的可靠性。

5 總結與展望

目前，臨床應用的可吸收屏障膜已經日趨成熟，但由于不同病例骨缺損修復的需求，急需擴大其臨床適應證，并確保成骨的療效，仍需對現有可吸收屏障膜如膠原膜、殼聚糖膜、PLA膜的促成骨方向改性進行探索，生長因子的體內外促成骨能力已被大量研究證實，將生長因子對骨形成相關細胞的調節作用及其可靠的促成骨能力與屏障膜有機結合是當前骨再生領域研究的新思路，但如何控制體內條件下負載生長因子屏障膜中生長因子的釋放仍是急需攻克的難題，由于釋放受擴散條件的限制，如pH、蛋白酶、外部磁場等，期望未來通過對屏障膜材料各種物理化學參數的改性及釋放條件的控制來實現生長因子的控釋。另外負載生長因子屏障膜的成本問題也是其臨床應用的障礙，未來尚需研究如何降低生長因子的生產成本及負載成本，從而獲得適應證廣泛、性價比高、骨再生效果明顯的新一代屏障膜。