地塞米松注射液聯合葡萄糖高滲液對兔眼角膜內皮的保護作用

李 彪，尹 利，曲 超，2

0引言

目前，白內障仍然是全世界第一大致盲眼病，隨著現代生活水平逐步提高，醫學不斷發展進步，人類平均壽命的延長，白內障發病率和患病率呈逐年遞增趨勢[1]。手術依然是治療白內障最有效的途徑[2]，白內障超聲乳化術因為治療效果好、手術時間短、創傷小、產生術源性散光低、術后恢復快等優點近年來被眼科醫生廣泛采用[3-4]，然而超聲乳化術后的一系列并發癥影響了手術效果，角膜水腫是其中最常見的術后并發癥之一[5]，國外有研究者報道超聲乳化術后角膜水腫的發生率為12.7%[6]。角膜內皮細胞在維持角膜正常厚度、透明性方面起著重要作用[7]，常規超聲乳化手術由于超聲乳化的能量及乳化顆粒的機械損傷均會引起角膜內皮細胞數量不同程度下降。但是通常角膜內皮細胞數量>1500cells/mm2手術都是安全的。以往的共識認為角膜內皮細胞數量<1500cells/mm2可以考慮白內障囊外摘除(extracapsular cataract extraction，ECCE)，但是隨著手術設備的優化，手術技巧的日趨完善，很多術者在探尋角膜內皮細胞數量的最低界限，目前角膜內皮細胞數量在400～800cells/mm2被認為是一個界限值。

超聲乳化術中，角膜內皮細胞受到損傷，術后早期細胞的能量主要用于兩方面：(1)自身修復；(2)Na+-K+ATP泵工作，保持角膜脫水狀態。因此如果術后早期(術后0～24h)使用高滲液保持角膜的脫水狀態，內皮細胞將節省出更多的能量，用于自身修復。我們在臨床觀察發現，術后第1d早上，通常是角膜能否經受手術考驗的關鍵時間點，如果術后第1d早上角膜透明，則角膜水腫不會再有加重。如果角膜水腫，高滲液的使用時間可能是病情的轉折點。本研究采用兔作為研究對象，探討地塞米松聯合高滲液對兔眼角膜內皮的早期保護作用，為臨床治療角膜水腫，防止角膜內皮失代償提供參考依據。

1材料和方法

1.1材料

1.1.1實驗動物與分組健康成年日本大耳白兔20只40眼(四川省人民醫院實驗動物中心提供)，雌雄不限，體質量2.0～2.2kg，均在裂隙燈顯微鏡下檢查，排除有眼部疾病者。按隨機數字表法分為A、B、C、D四組(每組5只10眼)。本研究通過四川省人民醫院醫學倫理委員會審查[No.倫審(研)2019年第273號]。

1.1.2主要試劑葡萄糖高滲液(50%葡萄糖注射液與維生素C注射液按5∶1比例配制，無菌操作，現配現用，4℃恒溫冰箱保存)；0.2%地塞米松注射液(辰欣藥業)；0.4%鹽酸奧布卡因滴眼液(參天制藥)。

1.1.3主要儀器眼科手術顯微鏡(Zessis S88，Zessis Corporation，German)；裂隙燈光學顯微鏡(Topcon Corproration，Janpan)；A超角膜厚度測量儀(Pachymeter SP-3000，Japan)；相干光斷層掃描成像系統(RTVuee100-2，America)；角膜內皮儀(Topcon SP-3000P，Janpan)。

1.2方法

1.2.1角膜水腫動物模型建立造模前用角膜厚度測量儀測量角膜中央厚度(CCT)，角膜內皮儀測量角膜內皮細胞計數，前節OCT檢查角膜。所有兔均采用30mg/mL戊巴比妥溶液(1mL/kg)耳緣靜脈注射麻醉，待進入全麻狀態后，將其側臥位固定于手術臺上，術眼常規消毒鋪巾。開瞼器開瞼，聚維酮碘+生理鹽水沖洗結膜囊，0.4%鹽酸奧布卡因1滴滴于結膜囊行表面麻醉，顯微齒鑷固定眼球，用2.4mm角膜穿刺刀分別于12∶00、3∶00位透明角膜緣做自閉性切口，前房維持器連接接有平衡液與滅菌注射用水按3∶7比例(基于前期實驗觀察結果，該比例既能建立兔眼角膜水腫模型，又不會導致兔眼角膜內皮失代償)配制的低滲液輸液器，瓶高75cm，從12∶00位進入前房，斜口朝向晶狀體但不接觸晶狀體及角膜，維持前房灌注，并用鈍性針頭穿刺入3∶00位切口，保持引流通暢，防止眼壓過高，并于顯微鏡下觀察角膜水腫情況，維持前房灌注10min。角膜霧樣水腫，則造模成功。若實驗操作過程中刺傷晶狀體或角膜，則按要求重新補充實驗動物。

1.2.2造模后處理A組：造模后立即予以地塞米松注射液0.2mL結膜下注射，高滲葡萄糖液按15min/次頻繁點眼；B組：造模后立即予以0.9%生理鹽水0.2mL結膜下注射，平衡鹽溶液按15min/次頻繁點眼；C組：造模后第2d予以地塞米松注射液0.2mL結膜下注射，高滲葡萄糖按15min/次頻繁點眼；D組：造模后第2d予以0.9%生理鹽水0.2mL結膜下注射，平衡鹽溶液按15min/次頻繁點眼。各組滴眼液滴眼每天持續8h，共7d。

1.2.3觀察指標

1.2.3.1兔眼角膜裂隙燈顯微鏡下觀察造模后第1、3、5、7d于裂隙燈下觀察兔眼角膜水腫情況，參考文獻[8]將角膜水腫程度分為0～4級：0級，角膜完全透明，無水腫；1級，角膜輕度水腫，可觀察到虹膜、晶狀體細節；2級，角膜中度水腫，可觀察到虹膜、晶狀體；3級，嚴重的角膜水腫，無法觀察到晶狀體；4級，彌漫角膜水腫，無法觀察到虹膜。

1.2.3.2兔眼CCT測量超聲測厚法是臨床上應用最廣泛的CCT測量方法[9]，被公認為是角膜厚度測量的“金標準”[10]。造模后第1、3、5、7d行裂隙燈檢查后測量CCT，具體方法為將兔固定于專用固定架上，以0.4%鹽酸奧布卡因表面麻醉后，使用A超角膜厚度測量儀測量CCT，測量5次取平均值。

1.2.3.3兔眼角膜內皮細胞計數造模后第1、3、5、7d全身麻醉后采用角膜內皮儀行角膜內皮細胞檢查，測量角膜內皮細胞計數。

1.2.3.4兔眼前節OCT檢查造模后第1、3、5、7d全身麻醉后行前節OCT檢查，觀察兔眼角膜水腫情況。

2結果

2.1兔眼角膜裂隙燈顯微鏡下觀察造模前，各組兔眼角膜透明(圖1A)。造模后，A組兔眼在整個實驗觀察中角膜保持透明，水腫程度為0～1級(圖1B)；C組兔眼造模后第1d角膜水腫最明顯，為2～3級(圖1D)，其后逐漸消退；B、D組兔眼造模后角膜水腫明顯，至造模后第3d最顯著，為3～4級(圖1C、1E)，最長消退時間為造模后21d，角膜基本恢復透明，未出現角膜大泡性病變，考慮與兔眼角膜內皮可再生有關。造模前后各組兔眼角膜水腫程度分級見圖2。

圖1 各組實驗兔造模后第3d裂隙燈下觀察角膜水腫情況 A：造模前，角膜透明；B：A組，角膜透明；C：B組，角膜彌漫水腫，眼內結構窺不清；D：C組，角膜水腫，但尚可觀察到虹膜；E：D組, 角膜彌漫水腫，眼內結構窺不清。

圖2 各組實驗兔在不同觀察時間點角膜水腫程度。

2.2兔眼角膜中央厚度測量結果造模前后不同時間點各組兔眼CCT測量結果比較具有時間差異性(F=1514.703，P<0.05)和組間差異性(F=801.98，P<0.05)，且不同組在不同時間上的變化趨勢具有差異性(F=29.402，P<0.05)，見表1～3。造模前，各組兔眼CCT測量結果差異無統計學意義(P>0.05)。造模后，A組兔眼CCT在實驗過程中變化不明顯；C組兔眼CCT在造模后第1d最高，其后逐漸下降；B、D組兔眼CCT明顯增加，在造模后第3d增加最明顯，其后逐漸緩慢下降。

表1 各組兔眼在不同時間測量的CCT值

表2 各組兔眼不同時間CCT的比較 P值

表3 不同時間各組兔眼CCT的比較 P值

2.3兔眼角膜內皮細胞測量結果造模前，各組兔眼角膜內皮細胞計數分別為2979.6±273.3、2947.4±210.3、3002.3±145.1、3017.8±125.3cells/mm2，差異無統計學意義(F=0.272，P>0.05)。造模后第1、3、5、7d，A組兔眼角膜內皮細胞數分別為2962.9±223.4、2984.9±232.6、2991.2±243.0、2983.7±251.1cells/mm2，差異無統計學意義(F=0.02，P>0.05)；造模后第7d，C組兔眼可測出角膜內皮細胞數為2821.8±141.1cells/mm2，與C組造模前相比差異有統計學意義(t=11.498，P<0.05)，與A組造模后第7d相比差異有統計學意義(t=-2.024，P<0.05)；B、D組兔眼由于角膜水腫在觀察期間無法測出角膜內皮細胞數量。

2.4兔眼前節OCT檢查情況兔眼前節OCT圖像可見，造模前各組兔眼角膜厚度正常(圖3A)；造模后，A組兔眼角膜無明顯增厚(圖3B)，C組兔眼角膜輕度增厚(圖3D)，B、D組兔眼角膜基質明顯水腫，厚度增加，超過OCT自動測厚上限(800μm)(圖3C、3E)。

圖3 各組實驗兔造模后第3d前節OCT檢查結果 A：造模前，角膜厚度正常；B：A組，角膜厚度正常；C：B組，角膜明顯增厚，超過OCT自動測厚上限；D：C組，角膜輕度增厚；E：D組，角膜明顯增厚，超過OCT自動測厚上限。

3討論

角膜內皮細胞在維持角膜透明性方面具有十分重要的作用。角膜內皮由一層厚約5μm的六角形扁平細胞構成，內皮細胞之間的縫隙連接及基質構成機械屏障連同細胞的離子泵功能，可防止過多水分進入角膜基質并將多余水分主動排出細胞從而維持角膜透明。人類角膜內皮細胞數量約2800～4000cells/mm2，并隨著年齡增加而逐漸減少，一般以每年0.6%的速度下降。此外，外傷、青光眼、糖尿病及多種角膜原發病如Fuchs角膜內皮營養不良、Peters異常、圓錐角膜[11]等均可造成角膜內皮細胞損傷。人類角膜內皮細胞不可再生，損傷后將由周圍的細胞擴大、移行代償其功能。Goktas等[12]通過動物實驗發現，角膜內皮細胞密度的危險閾值是1000cells/mm2，當細胞密度低于閾值時，角膜水腫的發生率成倍增長，若損傷導致角膜內皮細胞數量明顯減少，低于臨界值，殘余細胞將不能代償其功能，可導致角膜內皮失代償，發生嚴重角膜水腫，甚至角膜大泡性病變。目前對于術后角膜水腫的治療主要有藥物治療，包括類固醇激素、非甾體抗炎類藥物、重組人表皮生長因子滴眼液、谷胱甘肽、高滲液等，其中類固醇激素具有強大的抗炎作用，可抑制免疫反應，抑制炎性滲出，保護受損傷的細胞，而高滲液是輔助內皮細胞完成角膜脫水狀態的一種重要物質，可能幫助內皮細胞節約能量，從而使內皮細胞有更多的能量用于自身修復。

我們推測超聲乳化術后早期內皮細胞損傷最重，細胞剛剛經歷了手術損傷，包括超聲能量[13]、超聲乳化產生的熱量、皮質碰撞等機械性損傷、灌注液的損傷[14]等。術后早期，內皮細胞的生存環境也相對惡劣，前房的微環境處于恢復狀態，房水pH值、滲透壓、電解質及其他物質的含量都在逐步回歸正常狀態。因此，術后保護細胞的治療應該在手術結束后立即進行。同樣的治療措施，使用的時間不同，可能是完全不同的結果。本研究中，A組和C組采用同樣的藥物，但是不同的給藥時間，A組造模結束后，立即進行藥物保護，C組則是模仿臨床的傳統方法，臨床治療中總是在術后第1d早上若發現有問題才進行處理，我們認為這種做法可能錯過了最佳的治療時機。本研究發現，A組由于用藥時間早，可能使大量臨界細胞順利完成了自身修復，得以存活，所以僅在造模后第1d早上角膜有1級水腫，角膜厚度沒有明顯增加；而C組在造模后第1d早上角膜水腫嚴重，此后開始使用高滲液，角膜厚度變薄，但是，也許由于細胞負擔過重，導致更多角膜內皮細胞死亡，所以造模后1wk內，盡管高滲液連續使用，但是角膜厚度基本均在400μm以上，造模后各觀察時間點A、C組兔眼角膜中央厚度差異顯著。1wk后，C組兔眼角膜透明，第一時間測量了角膜內皮細胞計數，C組的內皮細胞數量明顯小于A組，這表明高滲液的延遲使用，導致了角膜內皮細胞更多的死亡。B、D組作為對照組，未給予地塞米松注射液結膜下注射和高滲液滴眼，在整個觀察期間，B、D組角膜明顯水腫，角膜內皮細胞無法計數。上述研究結果表明，地塞米松注射液聯合葡萄糖高滲液對兔眼角膜內皮具有保護作用，提前用藥對于角膜內皮的保護有著關鍵性的作用。本實驗的觀察期僅為7d，主要是由于兔眼角膜內皮細胞具有增生能力，這與人眼不同，長于7d的觀察受增生的影響較大，不能模擬臨床問題。我們觀察發現，3wk后各組兔眼角膜均接近透明。

綜述所述，地塞米松注射液聯合葡萄糖高滲液對兔眼角膜內皮細胞有良好的保護作用，早期聯合應用能有效預防及治療角膜水腫，避免進展至角膜內皮失代償。但本研究未比較單純使用地塞米松或葡萄糖高滲液的療效，需在后續研究中進一步探索。