Bruton酪氨酸激酶在對乙酰氨基酚誘導的小鼠肝損傷中變化及意義

劉曉慶，魯桓兵，劉瑞雪，宋育林

對乙酰氨基酚 (acetaminophen,APAP)是目前普遍使用的解熱鎮痛劑，過量使用則可導致嚴重的肝功能損害甚至急性肝衰竭乃至死亡，是藥物性肝損傷及肝衰竭的常見原因。APAP所致肝損傷發病機制復雜，涉及多種機制，可能與活性代謝產物的形成、氧化應激、內質網應激、自噬、無菌性炎癥等有關[1]，確切機制目前仍不明確。核苷酸結合寡聚域樣受體蛋白 3(nucleotide-binding oligomerization domain-like receptor protein 3, NLRP3)是肝臟中研究較多的炎性小體，其活化后可引起白細胞介素(interleukin, IL)-1β、IL-18等炎性因子的釋放，參與APAP誘導的肝損傷[2]。Bruton酪氨酸激酶(Bruton's tyrosine kinase,Btk)是胞漿非受體酪氨酸蛋白Tec家族成員之一，對B淋巴細胞的增殖、分化和凋亡起著重要的調控作用[3]。近期有文獻報道[4]Btk是先天免疫炎性反應中的關鍵因子，可通過調控核因子κB (nuclear factor κB, NF-κB) 引起NLRP3的激活，也可直接調控NLRP3的激活。已有研究[5]表明Btk參與缺血再灌注性肝損傷，抑制Btk可減輕肝臟的炎性損傷，然而其在APAP誘導的肝損傷中的作用及機制目前未見相關文獻報道，該研究重點研究APAP誘導的肝損傷中Btk、磷酸化Btk(phosphorylated Btk，p-Btk)、NF-κB、NLRP3、IL-1β、腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α) 的動態變化，從而探討Btk在APAP肝損傷中的重要作用及機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物54只SPF級健康成年的C57BL/6J雄性小鼠，鼠齡6～8周，體質量18～24 g，購自斯貝福(北京)生物技術有限公司，動物許可證號：SCXK(京)2016-0002。

1.2 實驗材料與儀器APAP(純度大于99%)購自美國MedChemExpress公司；小鼠TNF-α、IL-1β elisa試劑盒購自武漢基因美生物科技有限公司；Btk抗體[Btk(D3H5)Rabbit mAb×8547]、p-Btk抗體均購自美國Cell Signaling公司；NLRP3抗體購自英國Abcam公司；NF-κB抗體購自英國Abcam公司；RIPA裂解液、SDS-PAGE (5×) 蛋白上樣緩沖液均購自上海碧云天生物技術有限公司；全自動生化分析儀購自瑞士RocheModular 公司；紫外分光光度計購自上海菁華科技儀器有限公司產品；成像系統購自美國阿爾法公司產品。

1.3 方法

1.3.1實驗分組與方法 適應性飼養1周后，54只小鼠隨機分為9組，每周6只，分別為對照組(APAP 0 h組)、APAP 0.5 h組、APAP 1 h組、APAP 3 h組、APAP 6 h組、APAP 12 h組、APAP 24 h組、APAP 36 h組、APAP 48 h組，所有小鼠禁食不禁水12 h后，APAP 0.5 h組、APAP 1 h組、APAP 3 h組、APAP 6 h組、APAP 12 h組、APAP 24 h組、APAP 36 h組、APAP 48 h組小鼠分別單劑量腹腔注射APAP 300 mg/kg，對照組小鼠腹腔注射0.9%生理鹽水同等體質量APAP組小鼠。所有小鼠自由進食水，明暗各12 h，溫度20～25 ℃，相對濕度(50±5)%。所有小鼠均自由進食標準飼料。分別在相應的時間小鼠處死前稱量小鼠體質量，用10%的水合氯醛(4 ml/kg)腹腔注射麻醉后摘除小鼠眼球收集血液，斷頭處死。全血標本于4 ℃冰箱靜置過夜后，3 500 r/min離心15 min留取上清液，-20 ℃凍存待測。剪取部分肝左葉用10%福爾馬林緩沖液固定行肝臟病理學檢查，其余肝臟組織凍存于液氮中，隨后轉移至-80 ℃ 冰箱儲存待測。

1.3.2血清丙氨酸氨基轉移酶(alanine aminotransferase，ALT)、天門冬氨酸氨基轉移酶(aspartate aminotransferase，AST)活性檢測 全自動化生化分析儀檢測ALT、AST活性。

1.3.3肝組織病理學觀察 經10%福爾馬林緩沖液固定的肝臟標本，常規脫水，石蠟包埋，切片(厚5 μm)，HE染色，光學顯微鏡下觀察肝組織病理形態學改變。采用Image-Pro Plus 6.0高清晰圖像分析系統進行分析。計算肝臟壞死面積百分比=(陽性細胞所占面積/整個視野總面積)×100%。

1.3.4ELISA檢測肝勻漿IL-1β和TNF-α的表達 剪取-80 ℃凍存的肝組織按1 ∶9(g ∶ml)加入相應的PBS勻漿肝組織，留取上清液，嚴格按照試劑盒說明書操作步驟測定IL-1β、TNF-α。

1.3.5Western blot檢測肝臟Btk、p-Btk、NF-κB、NLRP3蛋白表達 剪取適量的肝組織加入RIPA裂解液充分勻漿提取總蛋白。用BCA法進行蛋白定量。加入SDS-PAGE (5×) 蛋白上樣緩沖液，沸水中煮沸 5 min，-80 ℃ 冰箱中凍存。以β-actin(1 ∶1 000)作為內參，以抗Btk抗體(1 ∶3 000)、抗p-Btk抗體(1 ∶1 000)、抗NF-κB抗體(1 ∶5 000)、抗NLRP3抗體(1 ∶2 500)和抗β-actin抗體(1 ∶1 000)作為一抗進行聚丙烯酰胺凝膠電泳。采用自動化學發光系統拍攝分析。

2 結果

2.1 ALT和AST酶活性檢測結果與對照組比較，APAP腹腔注射0.5、1 h組小鼠血清ALT、AST水平差異無統計學意義(P>0.05)；給藥后3 h血清ALT、AST升高，持續至24 h仍維持在較高水平(P<0.01)，36、48 h血清ALT、AST下降，但仍高于對照組(P<0.01)。見表1。

表1 不同時間點血清ALT、AST變化

2.2 肝組織病理檢查結果對照組，肝小葉結構正常，未見肝細胞變性、壞死以及肝竇充血。APAP處理后0.5、1 h肝臟病理形態學與對照組比較差異無統計學意義。APAP處理后3 h肝竇充血,可見點狀壞死灶，APAP處理后6、12 h肝竇充血明顯，壞死面積逐漸增大，持續至24 h，主要表現為小葉中心性壞死；APAP處理36 h后肝臟病理變化逐漸減輕，壞死面積逐漸減少。APAP干預后的各組小鼠肝臟壞死程度較對照組有變化(F=29.845，P=0.000)。見圖1、2。

2.3 肝組織勻漿IL-1β、TNF-α檢測結果與對照組比較，APAP腹腔注射1、3 h后，TNF-α、IL-1β分別開始升高，且均在24 h時含量最高(P<0.01)，后逐漸降低。見表2。

2.4 Western blot 檢測結果與對照組比較，APAP干預后的各組小鼠肝臟Btk(F=441.280，P=0.000)、p-Btk(F=1 323.022，P=0.000)、NF-κB(F=133.125，P=0.000)及NLRP3水平(F=820.095，P=0.000)含量均有變化。正常肝組織中僅有少量的Btk表達，APAP處理組小鼠隨著給藥時間的延長，Btk及p-Btk的表達逐漸增多，于24 h表達最高(P<0.01)，后表達逐漸下降。NF-κB、NLRP3表達與Btk及p-Btk表達變化趨勢相一致。見圖3。

圖1 不同時間點肝臟病理學變化 × 200

表2 不同時間點肝組織IL-1β、TNF-α表達量

圖2 不同時間點小鼠肝臟壞死面積

3 討論

APAP引起的肝損傷病理組織學主要表現為肝小葉中心性壞死[6-7]。ALT、AST是目前評價肝臟損傷程度的常用指標。本實驗結果顯示，小鼠單次腹腔注射APAP(300 mg/kg)0.5、1 h，血清ALT、AST及肝臟病理形態學與對照組無明顯差異；其余各組血清中ALT、AST水平、3 h后各組肝細胞壞死面積明顯高于對照組，同時肝臟HE染色也可見不同程度的肝竇充血。這些生化及病理改變與相關文獻報道[6-7]一致，提示APAP誘導的小鼠肝損傷模型復制成功。本實驗研究發現APAP(300 mg/kg)單次干預造成的肝損傷并非完全隨時間的延長而加重，36 h后肝損傷的程度有所減輕，提示單次APAP造成的小鼠肝損傷存在自身修復過程。

圖3 各組小鼠肝組織Btk、p-Btk、NF-κB、NLRP3蛋白表達情況

APAP誘導的肝細胞壞死的發生與過量服用APAP或肝臟基礎水平還原型谷胱甘肽被耗竭，代謝產生的N-乙酰對苯醌亞胺不能被肝臟還原型谷胱甘肽結合，造成肝細胞代謝損傷和氧化應激損傷，破壞線粒體膜等有關[1]。Btk是一種非受體型酪氨酸激酶，表達于除T淋巴細胞及漿細胞的髓系細胞。Btk通過調控中性粒細胞募集和激活參與炎癥過程[5]。當細胞受到細菌、真菌、病毒及其他危險信號的刺激時，Btk以磷酸化的形式活化后可直接調節NLRP3或間接調節NLRP3等信號進而引起炎性因子的釋放[3-4]。Btk參與調控多個重要炎癥信號轉導通路中許多關鍵的信號蛋白，包括NF-κB、NFAT、PKC、Pin1、TLRs、caveolin-1 等[8]。近期研究[5]表明在小鼠肝臟缺血再灌注損傷模型中，Btk抑制劑可減輕缺血再灌注引起的肝臟炎性損傷。本實驗結果顯示：正常小鼠肝組織中僅有少量Btk表達；APAP作用24 h內，隨著APAP作用時間的延長，小鼠肝組織中Btk及p-Btk逐漸升高，肝損傷的嚴重程度與Btk及p-Btk表達變化趨勢相一致。提示Btk的活化參與了APAP肝損傷病理的形成。

Btk是先天免疫炎性反應中的關鍵因子，參與調控炎癥信號轉導通路中許多關鍵的信號蛋白[4,8]，其參與APAP誘導的肝損傷可能作用機制為：① 激活NF-κB導致NLRP3形成及炎性因子升高。文獻報道Btk/NF-κB信號通路可參與視神經脊髓炎的發病，引起急性炎癥[9]。NF-κB可激活NLRP3炎性體造成炎性因子過度表達，進而導致炎癥和自身免疫疾病的進展[10-11]。抑制Btk、NF-κB信號通路可顯著控制炎癥及減輕疾病[12-13]。通過藥物或遺傳手段抑制Btk可嚴重抑制NLRP3炎性小體的激活，減輕IL-1β、IL-6、TNF-α等炎性因子的釋放，進而減輕缺血性腦損傷引起的炎性反應[14]。本實驗結果顯示，正常小鼠肝組織中僅有少量Btk表達，隨著APAP作用時間的延長，小鼠肝組織中Btk及p-Btk逐漸升高，NF-κB、NLRP3、IL-1β、TNF-α表達也逐漸升高，肝損傷的嚴重程度與Btk及p-Btk、NF-κB、NLRP3、IL-1β、TNF-α表達變化趨勢相一致。表明Btk磷酸化可能激活了NF-κB導致NLRP3形成及炎癥因子升高引起了肝損傷。② 直接激活NLRP3炎性小體。NLRP3炎癥小體的激活一方面主要通過激活NF-κB通路上調NLRP3和 pro-IL-1β的蛋白表達，另一方面線粒體DNA,穿孔毒素，病原體相關成分等信號也參與其激活[15]。近年來有文獻[14]報道Btk是NLRP3炎性小體的重要組成部分，在炎癥小體中起重要作用，可通過物理方式直接與NLRP3、ASC相互作用，激活炎性反應，引起炎性損傷。但APAP導致的急性肝損傷中，Btk激活NLRP3的確切機制尚有待進一步探討。

綜上所述，本研究結果顯示，Btk在單次APAP致肝損傷的過程中存在動態變化，APAP誘導的肝損傷中Btk、p-Btk、NF-κB、NLRP3、IL-1β、TNF-α表達變化與肝損傷的嚴重程度基本相一致，表明Btk可能在APAP肝損傷中起著重要作用，將為尋找APAP肝損傷新的防治靶點提供了理論基礎。