BET蛋白抑制劑JQ1增強索拉非尼對肝癌細胞的增殖抑制研究

王 宇，范璐璐

肝癌是臨床上常見的惡性腫瘤，據最新統計[1]，全世界新發肝癌患者每年約 70 萬，居惡性腫瘤的第 5 位，肝癌因此被稱為“腫瘤之王”。索拉非尼是治療晚期肝癌的重要一線靶向藥物，但其治療效果尚不滿意[2]，因此努力尋找有效的藥物和最優化的治療方法是當前的研究重點。溴結構域蛋白4(bromodomain-containing protein 4, BRD4)屬于溴化結構和BET家族蛋白，BRD4通過結合組蛋白誘導細胞的靶基因活化或抑制, 還可以結合乙酰化的非組蛋白, 來調控DNA復制、細胞周期及基因轉錄等其他細胞活動。因此，BRD4在腫瘤發生、發展中起著重要作用[3]。JQ1是一種小分子化合物, 是BET家族蛋白抑制劑, 可以競爭性結合于BRD4溴化結構, 阻止BRD4與乙酰化的賴氨酸結合[4]。該研究通過觀察JQ1聯合索拉非尼對肝癌細胞株的增殖抑制作用，并探討其可能的機制，為肝癌的臨床治療提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料人肝癌細胞株HepG2、Bel-7402購自中國科學院上海細胞庫；胎牛血清購自美國Gibco公司；DMEM高糖培養基購自美國Hyclone公司；索拉非尼購自美國Selleck公司；JQ1購自美國MedChemExpress公司；兔來源抗人Bcl-2單克隆抗體購自美國Abcam公司；兔來源抗人c-MYC單克隆抗體購自沈陽萬類生物科技有限公司；兔來源抗人BIM單克隆抗體購自美國CST公司；鼠來源抗人Actin抗體和所有二抗均購自北京中杉金橋生物技術有限公司；化學發光顯影試劑盒購自美國ThermoFisher公司；Annexin V-FITC細胞凋亡檢測試劑盒購自上海貝博生物科技有限公司；胰蛋白酶和DMSO均購自上海碧云天生物技術有限公司。

1.2 細胞培養所有細胞在含有10%胎牛血清，1%青霉素和1%鏈霉素的DMEM高糖培養基中培養，在含有5%CO2的培養箱中于37 ℃培養，1～2 d換液一次，在細胞對數生長期時進行傳代。

1.3 細胞增殖實驗MTT方法檢測細胞增殖抑制率。首先，將HepG2和Bel-7402以5 000個細胞/孔接種于96孔培養板中培養。用JQ1(1 μmol/L)、索拉非尼(10 μmol/L)、JQ1聯合索拉非尼分別處理細胞，同時設置空白對照組和陰性對照組，每組設置5個復孔，24、48 h之后向每個孔中加入10 μl MTT試劑，在37 ℃下孵育4 h。 然后，去除細胞培養上清液，并向每個孔中加入150 μl DMSO。 在37 ℃條件下孵育15 min。 最后，通過酶標儀在490 nm處確定每個孔的吸光度值。根據測量的吸光度值計算每個孔的增殖抑制率。

1.4 細胞凋亡實驗Annexin V-FITC/PI雙染檢測細胞凋亡。取對數生長期細胞消化計數后按2×105個/孔接種于6孔細胞培養板中。貼壁后加入DMSO、JQ1(5 μmol/L)、索拉非尼(10 μmol/L)、JQ1聯合索拉非尼分別處理細胞，24、48 h后用不含EDTA的胰蛋白酶消化細胞，獲取上清后使用預冷的PBS洗滌后離心，將離心后的細胞重懸于結合緩沖液中, 加入5 μl Annexin V-FITC室溫避光孵育15 min，之后加入5 μl PI混勻。室溫避光孵育5 min。使用FACS流式細胞儀測定凋亡細胞。早期和晚期凋亡細胞均包括在細胞死亡測定中。

1.5 蛋白提取與Western blot實驗取對數生長期細胞消化計數后按2×105個/孔接種于6孔細胞培養板中。貼壁后加入JQ1(5 μmol/L)、索拉非尼(10 μmol/L)、JQ1聯合索拉非尼分別處理細胞,同時設置對照組，24 h后加入含有蛋白酶抑制劑的裂解液置于冰上裂解30 min，將裂解物在低溫(4 ℃)和高速(15 000 r/min)下離心15 min。通過BCA試劑盒檢測上清液的蛋白質含量。在純化的蛋白質樣品中加入蛋白上樣緩沖液，并在95 ℃條件下加熱10 min。通過SDS-PAGE分離蛋白質樣品，并在恒定電流下轉移到PVDF膜上。使用5 %脫脂牛奶封閉含有蛋白質的膜，在4 ℃下與特異性一抗孵育過夜，然后加入相應的二抗(1 ∶50 000)在37 ℃孵育2 h。使用化學發光顯影液使蛋白質條帶可視化，上機掃描捕獲信號并保存。

2 結果

2.1 JQ1聯合索拉非尼對HepG2和Bel-7402肝癌細胞的增殖抑制作用使用MTT測定法分別檢測對照組、JQ1(1 μmol/L)、索拉非尼(10 μmol/L)、JQ1聯合索拉非尼作用于HepG2和Bel-7402肝癌細胞24 h或48 h后，肝癌細胞的增殖抑制率(圖1)。結果顯示，在HepG2肝癌細胞中，24 h各組的增殖抑制率分別是(14.31±0.79)%、(23.94±1.23)%、(32.36±1.72)%和(61.78±1.48)%；48 h各組的增殖抑制率分別是(8.47±1.73)%、(46.32±6.45)%、(54.40±1.30)%和(65.86±2.76)%。在Bel-7402肝癌細胞中，24 h各組的增殖抑制率分別是(7.43±1.65)%、(34.82±3.23)%、(44.87±7.34)%和(58.50±0.40)%；48 h各組的增殖抑制率分別是(8.77±1.90)%、(33.87±036)%、(42.61±9.50)%和(56.75±0.55)%。單獨應用索拉非尼或 JQ1以及JQ1聯合索拉非尼組均可在體外抑制肝癌細胞的增殖，與單藥組比較，聯合用藥組的增殖抑制率提高，差異有統計學意義(FHepG2,24 h=243.177，FHepG2,48 h=30.012，FBel-7402,24 h=7.62，FBel-7402,48 h=12.437，均P<0.05)。

圖1 JQ1聯合索拉非尼對肝癌細胞增殖率的影響

2.2 JQ1聯合索拉非尼對HepG2和Bel-7402肝癌細胞的凋亡作用使用Annexin V-FITC / PI流式細胞術測定對照組、JQ1(5 μmol/L)、索拉非尼(10 μmol/L)、JQ1聯合索拉非尼作用于HepG2和Bel-7402肝癌細胞24 h或48 h后的細胞凋亡率(圖2)。結果顯示，在HepG2肝癌細胞中，24 h各組凋亡率分別是(6.53±1.60)%、(9.03±1.44)%、(18.97±2.74)%和(34.00±4.14)%；48 h各組凋亡率分別是(4.57±0.85)%、(12.20±1.78)%、(27.96±7.59)%和(59.73±2.12)%。在Bel-7402肝癌細胞中，24 h各組凋亡率分別是(7.23±1.53)%、(10.83±1.70)%、(16.20±1.75)%和(26.30±1.43)%；48 h各組凋亡率分別是(7.87±0.63)%、(9.57±0.39)%、(16.60±4.65)%和(48.83±3.77)%。結果顯示JQ1聯合索拉非尼處理后，HepG2和Bel-7402肝癌細胞凋亡增加，差異有統計學意義(FHepG2,24 h=11.016，FHepG2,48 h=18.125，FBel-7402,24 h=8.174，FBel-7402,48 h=51.243，均P<0.05)。

圖2 JQ1聯合索拉非尼對肝癌細胞凋亡的影響

2.3 JQ1聯合索拉非尼對c-MYC、Bcl-2、BIM表達的影響通過Western blot檢測JQ1聯合索拉非尼對HepG2和Bel-7402細胞中c-MYC和凋亡蛋白Bcl-2，BIM的表達的影響，在索拉非尼和JQ1單獨用藥組，Bcl-2和c-MYC表達降低，BIM表達增加，以聯合用藥組最為明顯(圖3)。

圖3 JQ1聯合索拉非尼對c-MYC、Bcl-2、BIM表達的影響

3 討論

索拉非尼是一種口服多激酶抑制劑，是治療晚期肝細胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)的重要靶向藥物。但其療效尚不滿意[5]，因此，發現新的干預手段以期提高肝癌細胞對靶向藥物的敏感性，是一種治療腫瘤的新策略。

研究[9]表明在Bcl-2家族的多種成員中，Bcl-2是最主要的凋亡抑制基因，BIM是Bcl-2家族蛋白中最重要的成員，在Bcl-2家族蛋白的4個結構域(BH1～BH4)中，BIM與BH3具有相同的結構域，在本質上具有高度促凋亡作用。BIM在生理和病理生理條件下都啟動了內在的凋亡通路。BIM表達的減少與腫瘤的促進和自身免疫有關，而過表達則抑制腫瘤生長和耐藥性，因為癌細胞會抑制BIM的表達和穩定性[10]。c-MYC基因通過易位、擴增和突變參與許多腫瘤癌變過程，如神經母細胞瘤、乳腺癌、胰腺癌、結腸癌、前列腺癌等[11]。本研究Western blot結果顯示，各給藥組均可促進了BIM的表達，抑制Bcl-2的表達，致使HCC細胞的凋亡。以聯合用藥組最為顯著，JQ1和索拉非尼聯合應用可能存在協同作用。

綜上所述，一定濃度JQ1能增強索拉非尼對肝癌細胞的增殖抑制及凋亡作用，其機制可能在于通過下調Bcl-2和c-MYC的表達，上調BIM表達，JQ1和索拉非尼聯合應用可能存在協同作用，為肝癌的治療提供新思路。但是本研究只是在細胞水平的初步探討, 還需要大量的動物和臨床試驗進一步證明。