SNAP29調節胃癌細胞順鉑耐藥性的研究

張佳佳，喻 鑫，周 波，劉 弋

胃癌是消化系統常見惡性腫瘤之一，晚期胃癌預后較差。當前對于胃癌主要的治療手段包括外科手術、放射治療、化學藥物治療及靶向治療。由于當前針對胃癌的靶向治療藥物較少，化學藥物治療仍然是晚期胃癌的重要治療手段。順鉑是胃癌治療的常用化療藥物，但藥物耐受是亟待解決的重要問題[1-3]。該研究旨在檢測SNAP29基因對胃癌細胞順鉑耐藥性的作用，進一步分析SNAP29在胃癌患者中臨床病理學意義。

1 材料與方法

1.1 病例資料本課題收集了安徽醫科大學第一附屬醫院2017～2019年手術切除的患者石蠟組織標本，包括50例胃癌組織標本和50例正常胃組織標本，同時收集了胃癌患者的臨床病理學參數，包括患者的年齡、性別、腫瘤大小、腫瘤淋巴結轉移情況、腫瘤的分級和分期。患者對實驗的開展知情同意。

1.2 細胞培養實驗中涉及的胃癌細胞系MKN-45和AGS均來源ATCC (American Type Culture Collection)，均根據推薦條件在37 ℃恒溫5%CO2培養箱中進行培養，實驗時選取處于對數生長期的細胞進行實驗。

1.3 質粒合成和轉染實驗選取哺乳動物表達載體pIRESneo3 (Invitrogen)來構建SNAP29的過表達質粒。SNAP29的編碼序列(GenBank識別碼： NM_004782.4)克隆進pIRESneo3質粒，被命名為pIRESneo3-SNAP29。質粒轉染實驗使用lip2000 (QIAGEN)轉染試劑，按照說明書推薦的條件進行，參考文獻操作[4]。

1.4 Western blotWestern blot參考文獻操作[4]。對轉染后的細胞進行收集，使用細胞裂解液(Cell Signaling)裂解細胞并提取蛋白。提取的蛋白使用BCA Protein Assay kit (Pierce)試劑測定濃度。Western blot實驗過程包括電泳、轉膜、封閉、抗體孵育、酶標二抗孵育、顯影過程。實驗中主要的抗體包括兔SNAP29多克隆抗體(1 ∶1 000, 12704-1-AP)和鼠β-actin單克隆抗體(1 ∶10 000, 66009-1-Ig)(美國芝加哥Proteintech集團有限公司)。β-Actin作為內參。

1.5 MTT實驗MTT實驗參考文獻操作[4]。具體過程如下：已轉染的細胞24 h后消化打散成單細胞計數，種植于96孔細胞培養板中，每孔種植細胞5 000個，同組細胞種植3孔，細胞培養24 h后相應加入0、3、6 mg/L順鉑處理，48 h后進行MTT實驗檢測，測定570 nm的吸光度。

1.6 軟瓊脂克隆形成實驗軟瓊脂克隆形成實驗用于檢測細胞克隆形成。具體過程是在6孔細胞培養板中鋪設含0.5%瓊脂糖的1640培養基(1.5 ml)，凝固成下層膠，已轉染的細胞24 h后消化打散成單細胞后計數，取相應數目的細胞加入含0.35%瓊脂糖的1640培養基，種植于6孔板下層膠上，每孔對應5 000個細胞，1.5 ml培養基，室溫凝固后，上層加入2 ml的1640完全培養基(含10%胎牛血清和1%青霉素鏈霉素雙抗)。細胞種植48 h后相應加入0、6 mg/L順鉑處理48 h，細胞再培養4 d后檢測克隆形成。每組重復3孔，進行統計分析。

1.7 免疫組織化學實驗免疫組織化學實驗參考文獻操作[4]。具體過程包括石蠟組織切片的脫蠟、抗原修復、內源性過氧化物酶阻斷、抗體孵育、辣根過氧化物酶標二抗孵育、DAB顯色、蘇木精復染、切片脫水封片等過程。實驗使用邁新生物公司的Envision法免疫組織化學檢測試劑盒和兔SNAP29多克隆抗體(1 ∶200, 12704-1-AP，美國芝加哥Proteintech集團有限公司)。SNAP29為胞質表達，在組織中細胞表達比例≥15%被定義為SNAP29陽性，<15%被定義為SNAP29陰性。

1.8 統計學處理采用SPSS16.0軟件進行分析。本課題實驗均獨立重復3次，結果取平均值。MTT實驗和軟瓊脂克隆形成實驗結果使用t檢驗進行統計學分析。SNAP29表達水平與胃癌患者臨床病理學參數相關性分析使用χ2檢驗。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 在胃癌細胞MKN-45中過表達SNAP29檢測細胞對順鉑的敏感性在本研究中構建了SNAP29過表達質粒pIRESneo3-SNAP29，轉染MKN-45胃癌細胞系，記為MKN-45 SNAP29；對照pIRESneo3空質粒轉染的MKN-45細胞系被記為MKN-45 Vec。Western blot實驗顯示MKN-45 SNAP29細胞中SNAP29蛋白表達水平高于MKN-45 Vec細胞(圖1A)。MTT實驗表明，MKN-45 SNAP29和MKN-45 Vec細胞在不加順鉑情況下的細胞活力沒有顯著差異，順鉑可以抑制MKN-45 SNAP29和MKN-45 Vec細胞的細胞活力；在加入3和6 mg/L順鉑情況下，MKN-45 SNAP29細胞的細胞活力高于MKN-45 Vec細胞(P<0.05)(圖1B)。進一步細胞軟瓊脂克隆形成實驗顯示MKN-45 SNAP29和MKN-45 Vec細胞的克隆形成率無顯著差異，順鉑抑制MKN-45 SNAP29和MKN-45 Vec細胞的克隆形成，但是在6 mg/L順鉑處理后，MKN-45 SNAP29細胞的克隆形成率高于MKN-45 Vec細胞(P=0.008 3)(圖1C、D)。

圖1 在胃癌細胞MKN-45中過表達SNAP29檢測細胞對順鉑的敏感性

2.2 在胃癌細胞AGS中過表達SNAP29檢測細胞對順鉑的敏感性AGS細胞轉染SNAP29過表達質粒及對照空質粒，分別記為AGS SNAP29和AGS Vec。Western blot實驗顯示AGS SNAP29細胞中SNAP29蛋白表達水平高于AGS Vec細胞(圖2A)。與MKN-45細胞系相似，AGS SNAP29和AGS Vec細胞在不加順鉑情況下的MTT細胞活力無顯著差異，在加入3和6 mg/L順鉑后，AGS SNAP29和AGS Vec細胞的細胞活力均下降，但AGS SNAP29細胞的細胞活力高于AGS Vec細胞(P<0.05)(圖2B)。細胞軟瓊脂克隆形成實驗顯示，在6 mg/L順鉑處理情況下，SNAP29過表達的AGS細胞軟瓊脂克隆形成率高于對照細胞(P=0.012 7)(圖2C、D)。

圖2 在胃癌細胞AGS中過表達SNAP29檢測細胞對順鉑的敏感性

2.3 胃癌組織SNAP29的表達及其臨床病理學參數相關性分析本課題組通過免疫組織化學實驗檢測了50例胃癌組織標本和50例正常胃組織標本中SNAP29的蛋白表達，結果顯示在胃癌組織中SNAP29的陽性表達率是66.0%，在正常胃組織中SNAP29的陽性表達率是62.0%，兩者差異無統計學意義(P>0.05)(表1、圖3)。同時，本課題組收集了50例胃癌組織標本對應的患者臨床病理學參數(包括患者的年齡、性別、腫瘤大小、腫瘤淋巴結轉移情況、腫瘤的分級和分期)，進一步對SNAP29表達情況與這些病理學參數進行了相關性分析(表2)。在胃癌患者中，SNAP29陽性表達與胃癌患者的腫瘤淋巴結轉移(P=0.042)和腫瘤分期(P=0.023)具有相關性，而與胃癌患者的年齡、性別、腫瘤大小、腫瘤分級無相關性(P>0.05)。

表1 SNAP29在胃癌和正常組織中的表達

圖3 SNAP29在胃癌組織和正常組織中的表達 ×200A：胃癌組織；B：正常組織

表2 SNAP29表達與胃癌患者臨床病理參數相關性分析 [ n(%)]

3 討論

胃癌是嚴重威脅人類健康的惡性腫瘤，早期胃癌預后相對較好，晚期胃癌治療手段有限，預后較差。外科手術、輔助化療或放療是當前胃癌治療的主要方式。針對胃癌常用靶向藥物當前僅有曲妥珠單抗，它對HER2基因擴增的胃癌患者療效較好，但HER2基因擴增在胃癌中的比例僅僅10%～15%[2-3,5]。順鉑是胃癌常用化療藥物之一，對晚期胃癌的治療具有一定效果，但是長期用藥后患者往往產生獲得性藥物耐受。針對胃癌的順鉑耐藥，許多分子機制參與其中：Zhu et al[6]報道了miR-187靶向調控TGF-β/Smad信號通路參與調控胃癌細胞順鉑耐藥；SLFN11的甲基化作用促進胃癌細胞的順鉑耐藥性[7]；METase/lncRNA HULC/FoxM1信號通路通過抑制細胞自噬從而降低胃癌順鉑耐藥性[8]。關于胃癌順鉑耐藥的相關研究不勝枚舉，其相關機制復雜多樣，更進一步的研究迫切而必要。本研究首次報道SNAP29參與促進胃癌細胞對順鉑的耐藥，同時進一步揭示了SNAP29在胃癌患者中的病理學意義。

SNAP29屬于突觸體相關蛋白(SNAP)家族成員，參與SNARE(可溶性NSF附著受體)蛋白(SNARES)生物學功能。SNAP家族包括SNAP25、SNAP23和SNAP29，前兩種蛋白分別是膜相關蛋白，控制突觸傳遞，參與廣泛的非神經元膜融合過程；SNAP29僅短暫的與膜結合，它包含一個酸性NPF基序，介導與內吞因子的結合[9]。許多研究[9-13]表明SNAP29在信號轉導、細胞運動、細胞分裂、自噬和突觸傳遞等過程中均發揮重要作用。Mastrodonato et al[10]預測SNAP29可能在腫瘤發生發展以及神經退行性變中發揮重要作用。但目前為止，關于SNAP29在人體腫瘤中研究的報道十分有限，關于SNAP29在人體胃癌中的功能仍然是未知的。本課題在胃癌細胞MKN-45和AGS中轉染SNAP29過表達質粒，通過MTT實驗和細胞軟瓊脂克隆形成實驗研究SNAP29對細胞功能的作用。從圖1和圖2的結果來看，SNAP29的過表達對MKN-45和AGS細胞的細胞活力和細胞克隆形成能力均無顯著作用，因此可以推斷SNAP29對胃癌細胞的增殖能力并沒有顯著影響。

本課題在兩種胃癌細胞系MKN-45和AGS中，通過MTT實驗和細胞軟瓊脂克隆形成實驗兩種實驗方法證明了SNAP29的過表達能夠促進胃癌細胞對順鉑的耐藥性。但限于實驗條件限制，本課題沒有揭示出SNAP29促進胃癌順鉑耐藥的下游分子機制，這是下一步工作應該致力的方向。根據先前報道，SNAP29參與調控細胞自噬過程，SNAP29參與形成自噬體上的Syx17-Snap29復合物，是啟動復合體與溶酶體上的Vamp8融合的關鍵[9,13-14]。因此在胃癌細胞中SNAP29很可能參與促進細胞自噬，從而介導了促進順鉑耐藥的功能。Zhou et al[15]發現OGT的下調可以抑制SNAP29的O-GlcNAc修飾作用，從而促進了SNAP29-Stx17-VAMP8復合物的形成和細胞自噬過程，該機制促進了卵巢癌對于順鉑的耐藥性。因此SNAP29在胃癌中促進順鉑耐藥很可能是通過促進細胞自噬介導的，該具體機制在后續工作中將繼續研究。

本課題檢測了SNAP29在胃癌組織和正常胃組織中的蛋白水平，二者無顯著差異。SNAP29在正常胃組織中的陽性率高達62.0%，這表明SNAP29在正常組織中也是發揮重要功能的。據報道[9-13]SNAP29參與細胞的信號轉導、運動、有絲分裂、自噬和突觸傳遞等過程，因此在胃組織中SNAP29很可能也參與了細胞的相關生理過程，但其具體作用仍是未知的，也是后續工作需要進一步研究的方向。胃癌患者病理學參數相關性分析結果顯示，SNAP29與胃癌患者的年齡、性別、腫瘤大小和腫瘤分級無相關性，該結果證明了SNAP29在胃癌患者中的表達沒有年齡和性別傾向，與腫瘤的增殖和生長非顯著相關；SNAP29與胃癌患者的淋巴結轉移和腫瘤分期具有相關性，該結果證明SNAP29可能對胃癌的轉移具有一定促進功能。總體而言，SNAP29的高表達與胃癌患者的不良病理特征密切相關，在臨床上具有一定意義。

總之，本課題首次報道了SNAP29在人體胃癌中的功能，明確了SNAP29在胃癌患者中的病理學意義。該研究對于進一步了解SNAP29的生理學功能，胃癌順鉑耐藥機制具有一定意義，也為胃癌研究和治療提供了新的靶標。