雞豆黃素A對MPP+誘導PC12細胞凋亡的保護作用

俞益桂，薛海霞，韓俊輝，尹艷艷

帕金森病(parkinson's disease，PD)是世界第二大神經退行性疾病，臨床癥狀主要包括靜態震顫、運動遲緩和僵硬肌肉，其病理學特征為黑質(substantia nigra, SN)多巴胺(dopamine，DA)能神經元的凋亡和喪失[1-2]。研究[3]表明在PD疾病中，長期或嚴重的氧化應激可以誘導DA能神經元受到損傷甚至凋亡。相關研究[4]發現在細胞凋亡中活性氧(reactive oxygen species,ROS)-NO通路起到了至關重要作用，說明凋亡的啟動與ROS是密不可分的。含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(cysteinyl aspartate specific proteinase, Caspase)家族的激活一般被認為是細胞凋亡的重要一環，Caspase-9被凋亡相關因子誘導形成凋亡小體，而凋亡小體隨即激活凋亡執行者Caspase-3，而Caspase-3在很多凋亡信號的傳導過程中發揮重要作用[5]。雞豆黃素A(biochanin A，Bioch A)是從鷹嘴豆等豆科植物中提取分離的異黃酮類有機化合物，是一種天然的植物雌激素，該課題組前期實驗表明Bioch A對DA能神經元發揮保護作用與其對小膠質細胞活化，炎癥相關因子分泌和氧化應激等的抑制有關[6-7]。然而，Bioch A能否直接保護神經元尚待進一步研究。該文通過1-甲基-4-苯基吡啶離子 (1-methyl-4-phenylpyridinium, MPP+)損傷PC12細胞來建立體外模型，研究Bioch A能否通過抗氧化作用而發揮神經元保護作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1細胞株 從中國醫學科學院協和醫科大學基礎細胞中心細胞室獲得大鼠腎上腺髓質嗜鉻瘤細胞(pheochromocytoma cell, PC12)株。

1.1.2藥品與試劑 FBS和高糖DMEM完全培養基購自美國Gibco公司；MTT、Bioch A、PI、雌二醇(Estrodiol)和DMSO購自美國Sigma-Aldrich公司；青-鏈霉素混合溶液、胰蛋白酶(Trypsin)、ROS檢測試劑盒(DCFH-DA熒光探針法)、RIPA裂解液(弱)、BCA蛋白濃度測定試劑盒購自上海碧云天生物技術有限公司；PVDF膜購自美國Milliproe公司；超高敏的化學發光底物(Super Signal West Femto Kit)購自美國Thermo公司；HRP標記山羊抗兔IgG(1 ∶10 000)和HRP標記山羊抗鼠IgG(1 ∶10 000)、PBS和鼠抗β-actin抗體(1 ∶1 000)購自北京中杉金橋生物技術有限公司；Annexin V-FITC/PI細胞凋亡檢測試劑盒購自上海市貝博公司；一抗兔抗Caspase-3(1 ∶1 000)和兔抗Caspase-9(1 ∶1 000)均購自美國Bioworld公司。

1.1.3主要儀器 倒置顯微鏡CHL2FM3型購自日本OLYMPUS公司；全波長酶標儀SpectraMax190型購自美國Molecular Device公司；恒溫培養箱HealForce100型購自香港力康生物科技控股有限公司；bioshine ChemiQ4600 mini化學發光成像系統購自上海市歐翔科學儀器有限公司；自動細胞計數分析儀IC 1000-Countstar購自睿鈺(上海)生物科技有限公司；流式細胞儀BD FACSVerse購自美國Becton Dickinson公司；TGL-16H型高速離心機購自黑馬(珠海)醫學儀器有限公司。

1.2 方法

1.2.1PC12細胞的培養 將購回的PC12細胞，接種在含有10% FBS和1% 青-鏈霉素混合溶液雙抗的DMEM高糖培養基中于恒溫培養箱(5% CO2，37 ℃)進行培養。細胞每隔1 d更換1次培養液，2～3 d傳代1次。當細胞生長至對數生長期時，用胰酶消化細胞并進行傳代。

1.2.2MPP+和Bioch A劑量的篩選 為了檢測MPP+和Bioch A的濃度對PC12細胞活力的影響。實驗將PC12細胞分為7組。分別為MPP+(0、0.125、0.25、0.5、1、2、4 μmol/L)與Bioch A(0、0.625、1.25、2.5、5、10、20 μmol/L)組，每組加相對應的藥物孵育36 h。36 h后，每組加MTT 20 μl(5 mg/ml)，培育4 h。4 h后，棄去孔中培養液。每孔再加DMSO 200 μl，振蕩10 min以便結晶物完全溶解。用酶標儀在490 nm波長處測量各孔的吸光度值。

1.2.3實驗分組 本實驗PC12細胞被分為6組。Control組：未加任何藥物孵育36 h；MPP+組：加入1 μmol/L的MPP+孵育36 h；MPP++Bioch A(1.25、2.5、5 μmol/L)組：選用Bioch A(1.25、2.5、5 μmol/L)預處理細胞2 h后再加入1 μmol/L的MPP+共同孵育36 h；E2組：E2(0.1 μmol/L)預處理細胞2 h后再加入1 μmol/L的MPP+共同孵育36 h。

1.2.4ROS檢測 使用DCFH-DA探針法檢測Bioch A對MPP+刺激的PC12細胞的ROS表達的影響。加藥處理2 h后，Control組除外，剩余各組加入MPP+(1 μmol/L)培養36 h。36 h后進行 DCFH-DA孵育，孵育完成后，在顯微鏡下觀察并拍照，利用Image-Pro Plus 6.0軟件分析各組平均熒光強度。

1.2.5流式細胞儀測定細胞凋亡 用Annexin V-FITC/PI 凋亡檢測試劑盒雙染細胞來檢測Bioch A對MPP+刺激的PC12細胞凋亡的影響。使用胰蛋白酶消化細胞，1 000 r/min，離心5 min，棄上清液， PBS洗2次。加Binding Buffer 400 μl反復吹打使細胞混和均勻，細胞濃度高于1×105個/ml為宜，然后繼續加入 Annexin V-FITC 5 μl，搖勻，在避光條件下2～8 ℃放置15 min，后加入 PI 10 μl，搖勻，在避光2～8 ℃下靜置5 min，最后用流式細胞儀和顯微鏡檢測。

1.2.6Western blot 在培養好的細胞中加入含有蛋白酶抑制劑的細胞裂解液提取蛋白。BCA試劑盒定量后各組取適量樣品按樣品和蛋白上樣緩沖液4 ∶1比例進行變性。將變性后蛋白加入進行SDS-PAGE凝膠電泳，轉膜，后用脫脂奶粉和TBST溶液配制成濃度為5%的封閉液室溫下封閉1 h，封閉好的膜用TBST洗3次，后將膜置于相應的一抗中4 ℃過夜。次日，TBST洗3次后，室溫孵二抗1 h，然后再用 TBST洗3次，再按1 ∶1比例配制ECL發光液，將膜放在顯影儀中曝光，保存。用Image J軟件對蛋白條帶的灰度值進行分析。

2 結果

2.1 MPP+和Bioch A劑量的篩選采用MTT法檢測細胞活力為后續實驗篩出合適的MPP+和Bioch A劑量。從表1結果可以看出，MPP+劑量和細胞活力呈負相關，劑量增加活力下降，差異有統計學意義(P<0.05或P<0.01)。大多情況下，在MPP+刺激細胞凋亡模型中，細胞活力選擇在50%～60%比較適宜，因此選取MPP+(1 μmol/L)來刺激PC12細胞凋亡。 從表2結果可以看出，PC12細胞中加入Bioch A(0.625、1.25、2.5、5、10、20 μmol/L)36 h 后，Bioch A(0.625、1.25、2.5、5 μmol/L)組與Control組比較，細胞活力無明顯變化，因此選取3個濃度梯度的Bioch A(1.25、2.5、5 μmol/L)進行后續實驗。

表1 MPP+對PC12細胞活力的影響

表2 Bioch A對PC12細胞活力的影響

2.2 Bioch A對MPP+誘導的PC12細胞ROS表達的影響使用DCFH-DA熒光探針，來檢測MPP+刺激的PC12細胞ROS的熒光強度，用統計學手段分析各組ROS的表達情況。從圖1所示結果可以看出，MPP+模型組相較于Control組，ROS熒光強度增加；Bioch A(2.5、5 μmol/L)組以及 E2 組與 MPP+

圖1 Bioch A對MPP+誘導的PC12細胞ROS表達的影響

組比較，ROS表達量均有所減少，差異有統計學意義(P<0.05)。以上結果表明，Bioch A可以對MPP+刺激的PC12細胞內ROS的表達增加有一定的抑制作用。

2.3 Bioch A對MPP+誘導的PC12細胞凋亡的影響采用Annexin V-FITC/PI 雙染法和流式細胞儀來檢測Bioch A對MPP+誘導的PC12細胞凋亡的影響。從如圖2所示結果可以看出，MPP+處理36 h后，MPP+組相較Control組，細胞凋亡率達到(44.43±4.95)%(P<0.01)；Bioch A(2.5、5 μmol/L)預處理組與MPP+組比較，細胞凋亡百分率降至(31.57±2.25)%和(27.53±1.75)%(P<0.05，P<0.01)；E2預處理組與MPP+組比較，細胞凋亡百分率降至(19.63±1.95)%(P<0.01)。

2.4 Bioch A對MPP+誘導的PC12細胞cleaved Caspase-3和cleaved Caspase-9蛋白表達的影響采用Western blot法來檢測MPP+誘導的PC12細胞中cleaved Caspase-3和cleaved Caspase-9蛋白的表達情況，結果如圖3所示，MPP+組相較于Control組， cleaved Caspase-3和cleaved Caspase-9蛋白的表達增多，差異有統計學意義(P<0.01)；Bioch A(2.5、5 μmol/L)組以及E2組與MPP+組比較，cleaved Caspase-3和cleaved Caspase-9蛋白水平均有所降低(P<0.01，P<0.05)。結果表明，Bioch A對MPP+誘導的PC12細胞的cleaved Caspase-3和cleaved Caspase-9蛋白水平增加有一定的抑制作用。

3 討論

中樞退行性疾病與神經元功能的喪失有一定關聯，PD患者的黑質致密部80%的DA能神經元喪失了正常的功能。近年來，外源性的神經毒素誘導形成的PD細胞模型已成為PD發病機制重要的研究手段[8]。來源于大鼠腎上腺髓質嗜鉻細胞瘤的PC12細胞株，具有神經細胞的特性, 且可穩定傳代。MPP+是一種神經毒素, 能夠引起神經細胞的氧化應激，因此可作為誘導劑為PD的發病機制研究制備細胞模型[9]。MPP+可以直接被DA轉運蛋白有選擇性的轉運至DA能神經元，使神經元線粒體功能出現障礙，進而導致細胞凋亡的出現[10]。本實驗采用MPP+刺激PC12細胞凋亡建立體外PD模型，觀察 Bioch A 對MPP+刺激的PC12細胞凋亡的作用。不同濃度MPP+處理細胞，結果顯示1 μmol/L MPP+處理細胞能引起大約50%細胞凋亡,因此本實驗選用1 μmol/L MPP+用于后續造模。

圖2 細胞流式檢測Bioch A對MPP+誘導的PC12細胞凋亡的影響

圖3 Western Blot檢測cleaved Caspase-3和cleaved Caspase-9蛋白的表達

氧化應激與許多人類變性疾病有關, 如癌癥、動脈粥樣硬化以及神經退行性病變等,近年的研究[11]表明氧化應激與PD的發生發展密不可分。ROS增加是氧化應激的主要標志，在正常的機體或細胞內，ROS 總是與內在的抗氧化系統處于動態平衡中。當受到外界刺激時，平衡被破壞，從而產生氧化應激[12]。在本實驗中，Bioch A預處理能夠有效抑制MPP+組中的ROS的升高。此結果提示Bioch A可以減輕PC12細胞中MPP+誘導的氧化應激。此外，由于ROS作為凋亡啟動的一個重要條件，所以Bioch A也可能調節了細胞的凋亡過程。

Caspase家族的活化被認為是凋亡的直接效應物，因為其在凋亡進程中起到了不可忽視的作用。ROS等因素刺激線粒體，致使線粒體損傷和膜電位的下降，細胞色素C從受損的線粒體中釋放，細胞色素C和Caspase-9酶原共同作用形成凋亡復合體，其釋放并使Caspase-9活化，隨即活化的Caspase-9進一步刺激Caspase-3，降解底物導致細胞凋亡[13]。Caspase-3是細胞凋亡的常見途徑和執行者，其活化表明細胞凋亡進入了難以逆轉的階段，它的表達很大程度上能反映出細胞凋亡情況[14-15]。一般情況下，Caspase-3在細胞質內處于無活性狀態，但當其被外界刺激所影響時便可觸發自我凋亡程序, 通過關鍵蛋白酶的激活而加快細胞凋亡的進程。根據Western blot結果可以看出，Bioch A預處理能夠抑制MPP+刺激的PC12細胞Caspase-3和Caspase-9的活化。表明Bioch A對PC12細胞的凋亡起到一定程度的抑制作用。