CD155蛋白在胰腺癌組織和細胞系中的表達及其臨床意義

周海波，陳 炯，鄔高華，胡丕波，何俊飛

胰腺癌是一種惡性程度高的消化系統腫瘤，早期無特異性癥狀，大多數患者在臨床確診時已處于晚期階段，雖然目前胰腺癌的治療手段有了進步，但其5年生存率僅有9%，胰腺癌已成為全球第7大致死癌癥[1-2]。CD155蛋白(又稱人類脊髓灰質炎病毒受體，poliovirus receptor，PVR)是Nectin樣分子家族中的第5個成員，也屬于免疫球蛋白超家族成員，是DNAX輔助分子-1(DNAX accessory molecule-1，DNAM-1)的配體，研究表明其在結腸癌、肺癌多種惡性腫瘤中高表達，與腫瘤的進展、侵襲、轉移及預后等有關[3]。但是關于CD155蛋白的表達與胰腺癌組織之間的關系，目前國內外文獻報道較少。該研究運用免疫組織化學法檢測胰腺導管腺癌及其癌旁組織中CD155蛋白的表達情況，并分析其與臨床病理資料的關系，采用Western blot及qRT-PCR法分析胰腺正常細胞及胰腺癌細胞株中的CD155蛋白及mRNA的表達，旨在探討CD155表達與胰腺癌組織的相關性及其臨床意義。

1 材料與方法

1.1 病例資料人正常胰腺細胞株HPDE6-C7及胰腺癌細胞株Panc-1、BxPC-3、AsPC-1(中科院上海細胞庫)。收集安徽醫科大學附屬省立醫院普外科在2016年1月～2019年10月間接收的實施根治性手術切除并經病理證實為胰腺導管腺癌的組織及其對應的癌旁組織(距離癌組織 >2 cm)各92例。被研究者臨床資料完整，術前無放化療。其中：男56例，女36例；年齡40～79(61.43±9.05)歲，<60歲38例，≥60歲54例；胰頭癌、胰體尾癌分別為53、39例；高、中+低分化分別為35、57例；TNM分期參照AJCC分期第7版，其中Ⅰ～Ⅱ期54例,Ⅲ～Ⅳ 38例；淋巴結轉移及未轉移分別為50、42例；神經侵犯55例，未被侵犯37例。本實驗均得到醫院倫理委員會的批準及患者的知情同意。

1.2 主要試劑胎牛血清(杭州四季青公司)；RPMI1640培養基、DMEM 培養基(美國Hyclone公司)；TRIzol試劑(美國Invitrogen公司)；逆轉錄試劑盒(美國Thermo公司)；CD155一抗(美國CST公司)；二抗、免疫組化試劑盒(北京中杉金橋生物技術有限公司)。

1.3 實驗方法

1.3.1細胞培養 胰腺正常細胞(HPDE6-C7)、胰腺癌細胞(BxPC-3、AsPC-1)使用含10%胎牛血清的RPMI1640培養基培養，胰腺癌細胞(Panc-1)使用含10%胎牛血清的DMEM培養基培養，4種細胞均靜置于37 ℃、5%CO2條件下恒溫培養，2～3 d換液傳代。

1.3.2Western blot 從培養基中分別收取胰腺正常細胞及3株胰腺癌細胞，加入RIPA細胞裂解液提取蛋白，按照1 ∶4加入5×上樣緩沖液。沸水浴加熱10 min冷卻后上樣，SDS-PAGE電泳分離蛋白質，半干轉法將蛋白質轉移至PVDF膜; 5%脫脂奶粉封閉；滴加稀釋過的CD155一抗，4 ℃過夜；加入適當稀釋度的辣根過氧化物酶(HRP)標記的二抗,室溫孵育2 h后PBST洗滌3次，隨后加入ECL曝光顯影并使用Im-age J軟件進行條帶分析。

1.3.3qRT-PCR 按照TRIzol試劑盒提取胰腺正常細胞及3株胰腺癌細胞的RNA,根據逆轉錄試劑盒說明書操作合成cDNA。使用qPCR試劑盒進行擴增反應,反應體系為10 μl。以β-actin為內參，上游引物：5′-CCCTGGAGAAGAGCTACGAG-3′，下游引物：5′-GGAAGGAAGGCTGGAAGAGT-3′；CD155上游引物：5′-CCAGTGAGCACTCAGGTACA-3′，下游引物：5′-GTCTGTGGATCCTGGGAAGA-3′。采用2-ΔΔCt計算mRNA表達量，實驗重復6次。

1.3.4免疫組化 石蠟包埋標本3 μm連續切片，脫蠟后檸檬酸鹽高壓修復，緩慢冷卻至室溫，然后使用內源性過氧化物酶阻斷劑消除內源性過氧化物酶活性(30 min)，PBS沖洗3次，再滴加一抗CD155(1 ∶200)，4 ℃過夜，次日室溫下放置 30 min，PBS沖洗3次，隨后滴加二抗孵育30 min，PBS沖洗3次，加入適量DAB顯色，自來水沖洗，蘇木精復染，烘箱烘干，最后中性樹脂封片。

2 結果

2.1 CD155蛋白在正常胰腺細胞及3株胰腺癌細胞中的表達Western blot結果提示CD155蛋白在正常胰腺細胞和胰腺癌細胞中均有表達，但是在胰腺正常細胞中表達較低，HPDE6-C7 、Panc-1、AsPC-1、BxPC-3中CD155平均灰度值分別為(0.27±0.03)、(1.15±0.08)、(0.82±0.06)、(0.63±0.03)，四組之間差異有統計學意義(F=135.99，P<0.01),在胰腺癌細胞中由低到高的順序為BxPC-3、AsPC-1、Panc-1，與HPDE6-C7比較，差異有統計學意義(t=15.59、15.50、17.08，P<0.01)。見圖1、2。

圖1 胰腺正常細胞和3株胰腺癌細胞中CD155蛋白表達情況

圖2 胰腺正常細胞和3株胰腺癌細胞中CD155蛋白表達量

2.2 CD155 mRNA在正常胰腺細胞及3株胰腺癌細胞中的表達差異PCR結果顯示CD155 mRNA在正常胰腺細胞及3株胰腺癌細胞均有表達，HPDE6-C7、Panc-1、AsPC-1、BxPC-3中CD155 mRNA平均表達水平分別為(1.00±0.15)、(5.02±0.39)、(2.79±0.28)、(1.67±0.06)，四組之間差異有統計學意義(F=295.82,P<0.05)。與正常胰腺細胞HPDE6-C7比較,胰腺癌細胞(BxPC-3、AsPC-1、Panc-1)中mRNA表達量均比正常胰腺細胞高，其差異有統計學意義(t=10.38、14.13、17.08，P<0.01)，且mRNA結果與Western blot中CD155蛋白表達結果相一致。見圖3。

圖3 胰腺正常細胞和3株胰腺癌細胞中CD155 mRNA表達量

2.3 CD155蛋白在胰腺導管腺癌和癌旁正常組織中的表達免疫組化結果顯示CD155蛋白主要表達在胰腺導管腺癌組織的細胞膜上，胰腺導管腺癌組織中陽性表達率為65.22%(60/92),癌旁組織中陽性表達率為38.04%(35/92)，其差異有統計學意義(χ2=13.60，P<0.01)。見圖4。

圖4 CD155蛋白在胰腺導管腺癌和胰腺癌組織中表達情況 ×200

2.4 CD155蛋白的表達與胰腺導管腺癌臨床資料的相關性CD155蛋白的表達與胰腺導管腺癌的分化程度、神經浸潤、淋巴結轉移有關(χ2=12.451、16.614、10.551，P<0.05),而與患者的性別、年齡、腫瘤位置、TNM分期等無關。見表1。

表1 胰腺導管腺癌組織中CD155蛋白的表達與臨床病理關系 (n)

3 討論

DNAM-1(又稱DNAX輔助因子-1、CD226)是一種分子量為65 000的免疫球蛋白樣跨膜糖蛋白，可表達于NK細胞、T淋巴細胞、單核細胞和一部分B細胞的表面，CD155作為DNAM-1的配體，可分為膜表達型(mCD155)和可溶型(sCD155)兩種形式；有研究[3-5]報道DNAM-1受體與靶細胞膜表面配體CD155結合后可促使免疫細胞(如NK細胞、T細胞)活化，釋放穿孔素和顆粒酶等細胞毒性分子并誘導靶細胞的凋亡，CD155由于其突出的免疫功能，最近在腫瘤免疫學領域備受關注，與健康組織相比，CD155在人類惡性腫瘤中高表達，可與活化或抑制性受體結合參與免疫功能調節。

CD155與多種腫瘤的發生、發展緊密相連。Triki et al[6]對158例乳腺癌標本通過免疫組化發現CD155在乳腺癌中呈現高表達，其主要表達于細胞膜和細胞質中，細胞膜上CD155表達與NK細胞浸潤有關，并且細胞膜上高表達CD155的乳腺癌組織NK細胞浸潤的密度越高，相比較細胞膜上低表達CD155的乳腺癌患者，具有更好的預后和更高的生存率。Kearney et al[7]發現健康患者來源的NK細胞殺傷急性髓系白血病(AML)細胞需依賴CD155與DNAM-1的結合，當AML細胞不表達或低表達CD155時，不能促使NK細胞活化，降低了NK細胞裂解靶細胞的能力，而高表達CD155的AML細胞,NK細胞對其殺傷作用強，當使用硼替佐米上調低CD155表達的AML細胞，增強了NK細胞殺傷AML細胞的殺傷能力，這表明CD155的表達高低直接影響到DNAM-1依賴的NK細胞對AML細胞的殺傷作用的強弱。雖然這些研究顯示CD155高表達是誘導腫瘤凋亡的有利因素，但是也有研究表明抑制CD155的表達而發揮抗腫瘤作用。Zheng et al[8]用免疫組織化學方法檢測了97例結腸癌組織和癌旁正常組織的CD155表達情況，結果表明CD155在結腸癌中的表達比癌旁組織高，同時Western-blot方法也證實了結腸癌組織和細胞中CD155的高表達，分析與臨床病理間的關系發現CD155的表達與結腸癌AJCC分期和轉移相關，表明CD155的過度表達與結腸癌的進展有關，進一步的實驗研究顯示CD155基因敲除能抑制結腸癌細胞的增殖、侵襲、轉移以及促進結腸癌細胞的凋亡，其可能通過上調促凋亡分子和抑制抗凋亡分子的表達而發揮作用。上述的這些研究結果表明CD155的表達在不同腫瘤中發揮著重要的免疫功能，CD155可能成為腫瘤治療的新靶點，這為治療胰腺癌提供了新思路，或許能夠調控CD155的表達來探索胰腺癌治療的新方法。

本研究通過免疫組化法檢測了92例胰腺導管腺癌組織和及其配對的癌旁正常組織中CD155的表達情況，結果顯示胰腺導管腺癌組織中CD155表達高于癌旁正常組織，主要表達于胰腺導管腺癌組織的細胞膜上。為了驗證CD155在胰腺癌中的轉錄和翻譯水平，本課題組設計了Western blot和qRT-PCR兩項實驗來檢測胰腺癌細胞系和正常胰腺細胞CD155的表達，結果顯示胰腺癌細胞系中CD155蛋白和mRNA水平均高于正常胰腺細胞，其結果與免疫組化的結果相一致。進一步分析顯示CD155蛋白表達與胰腺導管腺癌的分化程度、神經侵犯及淋巴結轉移均有相關性，而與患者其它臨床資料無相關性。有研究[9-10]表明癌癥患者中DNAM-1受體表達降低或sCD155表達增加，降低了免疫細胞對腫瘤細胞的殺傷作用。Lee et al[11]發現雙陰性T細胞能通過DNAM-1與急性髓系白血病表面的CD155結合而發揮抗腫瘤作用，當阻斷DNAM-1受體后，其殺傷腫瘤細胞的能力降低。這表明DNAM-1與CD155的有效結合是免疫細胞殺傷腫瘤細胞的所依賴的途徑。根據這些研究者的發現，所以本研究推測胰腺癌患者中可能也出現DNAM-1的減少，導致機體內免疫細胞不能充分與胰腺癌表面的高表達的CD155結合，或者因sCD155的增多，與mCD155競爭結合DNAM-1受體,使活化的免疫細胞減少，從而降低了對腫瘤細胞的殺傷，使得胰腺癌得以進展。本實驗結果提示CD155在胰腺癌中的高表達可能與胰腺癌的發生、發展及預后存在一定的相關性，CD155的檢測可能有助于評估胰腺癌患者的臨床病情。

綜上，本研究表明CD155蛋白在胰腺導管腺癌中高表達，且與胰腺導管腺癌的分化程度、神經浸潤及淋巴結轉移有相關性，這些結果提示CD155可能參與了胰腺癌的發生、發展，提示CD155可能是預測胰腺癌預后的生物學標志物，同時因其的免疫功能，CD155有望成為胰腺癌治療的新靶點。課題組后期將通過體外細胞阻斷實驗研究免疫細胞是否通過CD155/DNAM-1途徑殺傷胰腺癌細胞，進一步闡述CD155高表達在胰腺癌中的作用。