1個北村網狀肢端色素沉著癥大家系ADAM10基因突變研究

葛宏松，張 成，周 潔，曹婷婷，董 瑛，吳建平，冉 穎，張 莉，李 明

北村網狀肢端色素沉著癥(reticulate acropigmentation of Kitamura，RAK)是一種罕見的色素障礙性遺傳疾病，常染色體顯性遺傳，外顯率高[1]，1943年由 Kitamura和Akamatsu首次報道后，在日本、印度、中國、尼泊爾、土耳其、伊朗、沙特阿拉伯、意大利和拉丁美洲等國家和地區人群中均有單個病例及家系報道[2-4]。但該病與屈側網狀色素異常病(dowling-degos disease，DDD)等[1]色素障礙性疾病在臨床上有許多相似性，過去由于技術原因，只能根據這些疾病的分布、形態、排列、發病年齡和有無低色素斑點對各種實體進行描述，同時該病本身也存在較大的臨床異質性，往往造成很多誤診。隨著分子遺傳學技術發展，一系列單基因色素障礙性疾病的致病基因被發現，這些疾病的診斷才逐漸清晰。2013年，Kono et al[5]首次確定了RAK的致病基因ADAM10，從而從基因水平區分開與其它臨床表現相近的色素障礙性疾病。該研究報道了在中國人群RAK臨床特點及新的ADAM10 基因突變位點。

1 材料與方法

1.1 家系成員調查先證者(46號患者)：女性，27歲，其女(53號患者)患有濕疹來安徽醫科大學附屬省兒童醫院皮膚科就診，發現其家族成員有多名患者，通過先證者聯系對家系進行現場調查，制作調查表以了解家族中各成員的臨床表現及發病情況，并繪制家系圖。

1.2 血細胞基因組DNA提取及分離經過患者及其他正常人簽署遺傳性皮膚病研究知情同意書后，采集家系中外周血樣本(患者血樣10例，正常對照12例)，同時采集無血緣關系中國漢族正常對照血樣100例，瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA的完整性和數量。使用血液DNA試劑盒[6](美國普羅米加公司)分離出DNA,該研究通過安徽醫科大學附屬省兒童醫院倫理委員會審查，符合赫爾辛基宣言。

1.3 PCR擴增及基因測序在線(http://www.genome.UCSC.edu/)查取POFUT1、POGLUT1、ADAM10、KRT5 以及 ADAR1外顯子及其剪接區域進行檢測，根據公布的基因序列設計ADAM10基因全部編碼外顯子的特異性引物(表1)進行PCR擴增，方法如下：5 min內升溫至94 ℃后，持續變性(94 ℃、30 s)，退火(55～60 ℃、30 s)，延伸(72 ℃、45 s)，共35個循環，最后充分延伸10 min。應用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測提取的PCR產物。PCR產物送上海安百隆生物技術服務有限公司進行正向測序，測序結果與以上5種人類基因組序列比較，如發現突變再行反向測序進行驗證。

2 結果

2.1 臨床表型資料共發現該家系5代共有成員54人(其中患者16人,正常38人，男25人，女29人，11人已去世)，家系中男女均發病(其中男患者7人，3人去世,女患者9人，3人已去世)，無隔代遺傳現象，符合常染色體顯性遺傳模式(圖1)。家系中先證者及所有患者發病年齡在10歲以后，皮疹逐漸加重，查體：一般情況可，頸部及手部的網狀色素沉著斑，未見色素脫失斑，無掌跖部凹陷損害，無其它系統性病變發現，先證者皮損組織病理顯示，色素斑處表皮輕微萎縮，角質形成細胞內黑素蓄積，基底層色素細胞增多(圖2)。

表1 擴增ADAM10基因16個外顯子引物序列及基因片段長度

圖1 RAK家系分布圖

圖2 RAK家系中先證者

圖3 RAK 家系患者ADAM10基因突變檢測

2.2 基因檢測結果每個樣品提取得到2 μg以上的基因組DNA，用瓊脂糖凝膠電泳檢測顯示均無明顯拖尾，基因組DNA完整性較好。各PCR產物用瓊脂糖凝膠電泳檢測顯示條帶單一，片段大小符合預期?；驕y序結果與參考序列比對顯示均為特異性擴增。引起色素異常的POFUT1、POGLUT1、KRT5 以及 ADAR1 基因未發現致病突變，而在ADAM10基因的第 4 號外顯子發生移碼突變，即 c.425-426 delGA; p.R142IfsX2，該突變在正常對照家系成員及無血緣關系的 100 例正常對照中并未檢測到，突變導致該蛋白截短，引起單倍型劑量不足，從而導致疾病的發生(圖3)。

3 討論

RAK的特征性表現為色素沉著、角狀、不規則的斑點樣病變，表面萎縮，在手、足背、頸部呈網狀排列[1]。病變通常開始于兒童期或青春期，逐漸擴展到四肢，很少發生在面部和眼瞼。隨著時間的推移，病變逐漸變暗，陽光會使病情惡化。掌心、腳底和指骨背表面的皮紋有凹坑和裂口,伴掌跖皮膚紋理破壞。色素斑的病理檢查可見表皮萎縮，表皮突延長，黑素增加。但不是所有患者均具有掌跖和指(趾)表面小凹陷，皮膚紋理破壞。本組患者表現為網狀的雀斑樣色素沉著斑分布于手足背面及頸部，皮疹表現為萎縮性的斑片，無色素減退斑及掌跖部蟲蝕樣損害，所有患者大約10～20歲間發病，逐漸加重，未見其它系統性損害。

RAK的鑒別診斷以網狀或點狀色素沉著為表現的疾病，包括網狀色素性皮病[1](dermatopathia pigmentosa reticularis,DPR)：2歲左右嬰兒期發病，軀干部多見，可累及頸、肩、大腿等部位,伴有色素沉著、非瘢痕性禿發和甲病三聯征，組織病理為真皮上部大量色素及噬色素細胞。遺傳性泛發性色素異常癥(dyschromatosis universalis hereditaria，DUH)：大多數1歲內發病，晚發偶見,全身皮膚甚至黏膜可見界限清楚的棕色及白色斑，混雜分布，主要累及軀干及四肢近端，偶伴系統損害，組織病理示表皮色素顆粒增加及色素失禁，Xing et al[7]將此病的致病基因定位于6號染色體6q24.2-1q25.2區域。遺傳性對稱性色素異常癥(dyschromatosis symmetrica hereditaria，DSH)：一種肢端色素沉著病,通常起于嬰兒期或幼兒期，青春期明顯，持續終身，表現為手、足背點狀黃褐色至褐色斑點夾雜脫色素斑疹，構成網格樣圖，組織病理表皮下層色素增加真皮上層噬色素細胞多見及少量炎性淋巴細胞，脫色素斑處基底層色素減少甚至消失。2003年Zhang[8]課題組首次將DSH致病基因定位于1號染色體 1q11-1q21區域內，隨后發現致病基因ADAR[9]。家族性進行性色素沉著癥褐色斑出生后發生，隨年齡增大逐漸增多，好發于眼周、口周、頸側、軀干、四肢及手足背部雀斑樣斑點，其間可見正常皮膚，病理示基底層色素增加、色素細胞正常，Wang et al[10]在國際上首先明確該病的致病基因為KITLG。DDD一般為20歲以后發病,主要見于頸、乳房下、腋窩、臀間、腹股溝等屈側花紋樣棕褐色斑，也可累及軀干和前臂， 近年來，關于RAK與DDD共存于同一患者的報道越來越多，但在2006年，Betz et al[11]首先發現部分DDD是由KRT5基因突變所致；在2013年[12]，排除了KRT5基因突變后，國際上首次報道了泛發性DDD是由POFUT1基因突變所致，Kono et al[5]首次應用全外顯子組測序確定ADAM10突變是造成RAK的原因，這是一種不同于DDD等其他色素POFUT異常性疾病，同時，在5個RAK家系中，確定了6種ADAM10基因突變。在RAK家族中發現了ADAM10基因突變，該基因編碼鋅金屬蛋白酶、崩解素和ADAM 10。眾所周知，ADAM 10參與了皮膚中各種基質的外域脫落，因此，遺傳研究顯示RAK和DDD是不同的疾病。2018年，Pan et al[13]在2例單獨發病的中國RAK患者中，通過測序分析檢測出ADAM10內含子突變(c.2026-2A >G)。ADAM10蛋白參與多種生物過程，包括調節角質形成細胞中黑色素的分布和轉運過程。迄今為止，包括本組患者在內，共報道了14個ADAM10突變導致RAK。在這些患者中，甚至在ADAM10突變相同的家庭成員中，也發現了色素沉著和凹陷分布的多樣性，以及其他特征的存在，如特應性皮炎、腦膜瘤和足底角化病。RAK的表型復雜性提示，除了ADAM10突變外，其他迄今未知的環境或遺傳因素也可能與RAK的發病機制有關。

1998年，Yavari et al[14]通過FISH技術把ADAM10基因定位于15q22。人類ADAM10的mRNA含3 410個堿基，16個外顯子，基因的上游區域可能存在BRN2、SREBP、OCT1和NFKB等的結合位點。Hartmann et al[15]建立了ADAM10缺陷小鼠，該小鼠在胚胎9.5 d死亡，通過原位雜交顯示，該小鼠NOTCH 靶基因 Hes5在神經管中的表達下降，而NOTCH配體DLL1的表達則增加，表明 ADAM10在NOTCH信號通路中發揮著重要作用。進一步的研究還顯示，ADAM10 是小鼠邊緣區B細胞發育必不可少的。缺乏ADAM10的B細胞 NOTCH2信號通路嚴重受損，ADAM10作為CD23的釋放酶，可能以某種不可被替代的機制，啟動了NOTCH2信號通路。Kono et al[5]報道ADAM10單倍體功能不足引起無毛小鼠皮膚上雀斑樣色素沉著，小鼠的色素斑首發于四肢背側，成年鼠軀干可觀察到彌漫性色素沉著。這一表現類似于人類的RAK。但兩者明顯的區別是，小鼠出現色素沉著需要同時具備ADAM10突變致單倍體功能不足和無毛基因純合突變兩個條件。而人類RAK患者，全身毛發正常，且經檢測，也不存在無毛基因的任何突變。

綜上，雖然以前的研究已經明確RAK是由ADAM10基因異常所致，也已經建了兩個ADAM10突變小鼠模型，但這兩個模型一個在胚胎期即死亡，另一個需同時合并無毛基因的純合突變，均與人類RAK有明顯的不同，不適合進行 RAK發病機制的研究。所以，ADAM10基因突變如何影響人類的黑素形成，如何導致人類皮膚的色素代謝障礙，最終使患者的皮膚表現出RAK 表型，需要進一步研究。本研究中患者的臨床僅表現為頸、手部的網狀色素沉著斑，無掌跖部凹陷損害，新ADAM10基因4號外顯子突變的發現，豐富了該病突變庫，同時對該家族成員今后的產前診斷、優生優育有一定的幫助。