去甲斑蝥素對雄激素非依賴型前列腺癌PC-3細胞增殖、凋亡的影響*

雒向寧,王文娟,李 凱,杜宏宏

1.陜西中醫藥大學附屬醫院泌尿外科(咸陽712000);2.陜西中醫藥大學生物實驗中心(咸陽712000)

前列腺癌是最常見的男性生殖系統惡性腫瘤，多見于60歲以上的老年男性。據統計，美國男性人群中大約有15%會發生前列腺癌[1]。近10年以來，我國的前列腺癌發病率也呈逐年上升趨勢。前列腺癌包括雄激素依賴型(Androgen dependent prostate cancer，ADPC)和雄激素非依賴型(Androgen independent prostate cancer，AIPC)。絕大多數前列腺癌患者起初為ADPC，即對抑制雄激素的內分泌藥物治療敏感有效。然而，經抑制雄激素的內分泌治療平均2.5年后，上述患者均將轉化為AIPC，即對抑制雄激素的內分泌治療無反應。后者病情進展迅速，生存期一般不超過18個月。因此，AIPC的替代治療藥物研發成為研究熱點。去甲斑蝥素是從動物類藥物斑蝥蟲體內提取斑蝥素的去甲基化類似物。現有研究顯示，去甲斑蝥素具有強大的抗癌活性，目前已應用于多種惡性腫瘤的臨床治療。本次實驗重在研究去甲斑蝥素是否具有抑制AIPC細胞PC-3增殖及誘導其凋亡的作用。

材料與方法

1 實驗材料 PC-3細胞株購自上海細胞所國家細胞庫；去甲斑蝥素購自Aladdin公司，CCK-8細胞增殖及細胞毒性檢測試劑盒購自Beyotime公司，細胞周期檢測試劑盒購自南京凱基生物公司，熒光倒置顯微鏡(日本，OLYMPUS)，CO2恒溫培養箱(日本，SANYO)，酶標儀(美國，Thermo)。

2 實驗方法 ①細胞培養：將解凍復蘇后的PC-3細胞接種在含有 10% 胎牛血清的完全培養液中，在37 ℃ 5% CO2培養箱內，飽和濕度條件下培養。②細胞生長抑制實驗：參照CCK-8細胞增殖及細胞毒性檢測試劑盒步驟說明，取處于對數生長期，生長狀態良好的PC-3細胞，用1640培養基調整細胞密度到5×103個/100 μl，接入96孔板，每孔100 μl細胞懸液，同時設空白對照組，37 ℃培養過夜，加入100 μl不同濃度培養液配制的去甲斑蝥素，使最終濃度為12.5、25.0、50.0 μg/ml，每組3個復孔，37 ℃培養48 h。培養結束以后，每孔加入10 μl CCK-8，37 ℃培養4 h，用酶標儀檢測450 nm處吸光度值。③細胞周期和凋亡率測定：按照細胞周期檢測試劑盒說明，取對數生長期的PC-3細胞，加入不同濃度的含去甲斑蝥素培養液，使去甲斑蝥素最終濃度分別為12.5、25.0、50.0 μg/ml，同時設立空白對照組，37 ℃分別培養48 h。流式細胞儀檢測細胞周期和凋亡率，倒置顯微鏡下觀察細胞形態。

結 果

1 去甲斑蝥素對PC-3細胞生長的影響 空白對照組、12.5、25.0、50.0 μg/ml的去甲斑蝥素作用于PC-3細胞，作用48 h后，PC-3細胞受到不同程度地抑制，并呈劑量-效應關系。去甲斑蝥素濃度為12.5、25.0、50.0 μg/ml時的抑制率分別為(22.16±4.26)%、(46.71±0.98)%、(52.54 ±3.48)%，隨著去甲斑蝥素藥物濃度的增加，對PC-3細胞的生長抑制效果越加增強，呈現明顯的量-效關系，與空白對照組比較，差異均有統計學意義(P<0.05)。IC50為45.87 μg/ml。

2 去甲斑蝥素對PC-3細胞周期的影響 去甲斑蝥素作用PC-3細胞48 h后，可使PC-3細胞的G0/G1期細胞顯著減少，S、G2期PC-3細胞增加，且作用隨著去甲斑蝥素的濃度增加呈現劑量-效應關系，見表1、圖1。

A：空白對照組；B：12.5 μg/ml 去甲斑蝥素組；C：25.0 μg/ml 去甲斑蝥素組；D：50.0 μg/ml 去甲斑蝥素組

表1 不同濃度去甲斑蝥素對PC-3細胞周期的影響

3 去甲斑蝥素對PC-3凋亡率的影響 流式細胞法測定三種去甲斑蝥素濃度劑量作用于PC-3細胞48 h后的凋亡率，與空白對照組比較差異有統計學意義(P<0.05)，且作用隨著去甲斑蝥素的濃度增加呈現劑量-效應關系，見表2。

表2 不同濃度去甲斑蝥素對PC-3細胞凋亡率的影響

4 倒置顯微鏡觀察細胞形態 空白對照組、12.5、25.0、50.0 μg/ml去甲斑蝥素組分別作用于PC-3細胞48 h后：空白對照組PC-3細胞活躍生長，呈上皮樣貼壁繁殖，細胞之間緊密連接。各濃度去甲斑蝥素組PC-3細胞體積均變小、變圓，細胞膜完整，細胞間連接疏松，貼壁能力明顯減弱，吹打易離壁漂浮，生長明顯受抑制。且生長抑制率與去甲斑蝥素濃度正相關。見圖2。

討 論

絕大多數前列腺癌患者類型起初為雄激素依賴型，即對抑制雄激素的內分泌藥物治療敏感有效，因此，雄激素剝脫治療(Androgen deprivation therapy，ADT) 是目前針對ADPC患者重要的治療方法。但經過平均2.5年的治療后，上述類型的患者將進展為雄激素非依賴型，即經過ADT治療，由于前列腺癌細胞的雄激素受體改變等原因，導致患者對ADT治療失效，進入AIPC階段，出現疾病進展[2]。針對ADT治療失效的前列腺癌患者病理機制的基礎研究顯示，AIPC患者體內的前列腺癌組織中，仍存在持續分泌雄激素的能力，雄激素高水平的持續表達，可以繼續活化雄激素受體，刺激患者機體前列腺癌細胞不斷增殖，使得前列腺癌病情惡化蔓延[3-4]。由此可見，阻斷雄激素合成或轉化，仍然是治療ADT失效的前列腺癌的關鍵機制。近年研究發現的CYP17，是一種阻滯機體合成雄激素的關鍵限速酶，已經證實，CYP17廣泛存在于機體的部分內分泌器官(如腎上腺、前列腺和睪丸組織)。而醋酸阿比特龍能夠特異性抑制CYP17的活性，能夠抑制來源于上述內分泌器官、尤其是前列腺癌細胞的雄激素合成[5]，屬于新一代的雄激素抑制藥物，能夠有效抑制雄激素在上述組織、特別是前列腺癌組織的生物合成。最新研究結果顯示，醋酸阿比特龍可以特異性地結合CYP17酶，且親和度較高，能夠有效地減少相關內分泌組織器官的雄激素分泌。減少自然合成來源的雄激素和前列腺癌組織內的雄激素水平，最終達到遏制ADT治療失效的AIPC的疾病進展。然而，基于上述醋酸阿比特龍的特殊藥理機制，患者在服用該藥物后，將不同程度地引起患者促腎上腺皮質激素含量的升高，從而容易發生高血壓、低鉀血癥和水鈉潴留等副作用，嚴重者甚至出現嚴重的肝腎毒性損害[6]。同時，醋酸阿比特龍價格較為昂貴，對患者帶來較大的經濟負擔，上述各種因素的存在，限制了阿比特龍的臨床應用。

去甲斑蝥素是一種由我國最先成功提取合成的新型抗腫瘤藥物，是由動物類中藥斑蝥蟲體內提純的斑蝥素的衍生物(斑蝥素去除1，2位兩個甲基)，能夠發揮強大的抗癌作用[7]，并且同時具有升高患者外周血白細胞的作用。本實驗首先采用CCK-8法觀察了去甲斑蝥素對人前列腺癌PC-3細胞生長增殖的影響。實驗結果表明，與空白對照組相比，濃度為12.5、25.0、50.0 μg/ml的去甲斑蝥素作用PC-3細胞48 h，均可顯著抑制人前列腺癌細胞PC-3的細胞生長，且呈濃度依賴性。其IC50值為45.87 μg/ml，說明去甲斑蝥素可濃度依賴地抑制前列腺癌PC-3細胞的生長增殖。流式細胞術檢測發現，去甲斑蝥素可使前列腺癌PC-3細胞的G0/G1期細胞顯著減少，S、G2期PC-3細胞增加，且作用隨著去甲斑蝥素的濃度增加呈現劑量-效應關系。流式細胞術檢測12.5、25.0、50.0 μg/ml濃度的去甲斑蝥素作用PC-3細胞48 h凋亡率，提示去甲斑蝥素可以明顯增加PC-3細胞的凋亡率，且與去甲斑蝥素的作用濃度正相關。通過倒置顯微鏡觀察不同濃度去甲斑蝥素作用48 h后的PC-3細胞，細胞體積均變小，細胞間連接疏松，貼壁能力明顯減弱，易離壁漂浮，生長明顯受抑制，且生長抑制程度與去甲斑蝥素的干預濃度正相關。上述實驗結果表明去甲斑蝥素能夠抑制PC-3細胞生長，可能的機制是去甲斑蝥素誘導PC-3細胞發生凋亡并阻滯PC-3細胞的有絲分裂。

根據現有研究，去甲斑蝥素抗腫瘤作用機制主要包括以下5個方面。①抑制腫瘤細胞增殖：惡性細胞以有絲分裂方式“無限增殖”是產生人體惡性腫瘤細胞的直接原因。多項實驗發現，去甲斑蝥素對人體多種惡性腫瘤細胞的增殖呈現出抑制效果。有國內學者[8]研究去甲斑蝥素對體外培養乳腺癌MCF-7細胞的抑制作用，結果表明，去甲斑蝥素能有效抑制MCF-7細胞體外增殖速度，且高濃度、長時間的去甲斑蝥素抑制效果更明顯，存在去甲斑蝥素作用濃度與時間的依賴性。另有學者觀察到去甲斑蝥素對體外培養肺癌細胞A549呈現顯著的抑制作用，進一步研究發現[9]，肺癌A549細胞在去甲斑蝥素作用下，大量細胞阻滯于G2/M期，同時癌細胞內的ER-K1/2基因表達明顯降低。②促進腫瘤細胞凋亡：正常的人體細胞，增殖和凋亡是一對同時存在的生命現象，兩者長期處于此消彼長的穩定狀態，而惡性腫瘤細胞的增殖和凋亡則打破了兩者的穩定關系，進入“失衡狀態”。人體惡性腫瘤細胞發生的重要原因之一，正是由于凋亡過程在細胞內受到某些因素抑制，使細胞不能進入“程序性死亡”，出現惡性無限增殖現象。有學者[10]采用不同濃度的去甲斑蝥素作用于人肝癌SMMC-7721細胞后，檢測凋亡相關因子的表達，結果發現，去甲斑蝥素可促進Caspase-3、Bax和細胞色素C的表達，發揮誘導SMMC-7721細胞凋亡的作用，并且上述三種凋亡相關因子的表達量與去甲斑蝥素的作用濃度正相關。實驗研究顯示[11]，不同濃度的去甲斑蝥素處理人胃癌SGC-7901細胞后，抗凋亡蛋白因子表達減少，促凋亡蛋白因子表達則顯著增加，不同濃度去甲斑蝥素均對SGC-7901細胞產生促凋亡作用，使得SGC-7901細胞結構破壞，生長周期停滯在G2/M期，且其促凋亡作用與藥物作用時間及藥物濃度呈相關性，說明去甲斑蝥素是通過調控腫瘤細胞各種抗凋亡因子與促凋亡因子的表達來發揮誘導腫瘤細胞凋亡作用。③抑制腫瘤細胞DNA復制：DNA復制起始蛋白是所有真核細胞啟動DNA復制必須的調控因子，包括Cdc-6、Orc、Cdt1和Mcm2-7，其中Cdc-6蛋白屬于癌基因蛋白，可促發良性細胞向惡性轉變。通過抑制Cdc-6的表達，可以產生抗癌作用。實驗研究顯示[12]，在去甲斑蝥素的藥物作用下，人宮頸癌HeLa細胞、人肝癌HepG2細胞、T淋巴瘤Jurkat細胞以及人B淋巴細胞瘤Ramos細胞的DNA復制起始蛋白Cdc-6均被明顯降解，上述各種惡性細胞的體外生長均受到抑制，并呈現去甲斑蝥素藥物劑量依賴性。說明去甲斑蝥素能夠直接干擾細胞DNA的遺傳復制，實現抑制腫瘤細胞復發和擴散的目的。④干擾腫瘤細胞的細胞周期：有絲分裂也是腫瘤細胞的生長方式。有研究顯示[13]，去甲斑蝥素作用于人卵巢癌SK-OV-3細胞時，可以將癌細胞大量阻滯于有絲分裂的G2/M期，使有絲分裂停滯不前。有學者[14]采用去甲斑蝥素作用于白血病K562細胞株，發現去甲斑蝥素可將K562 細胞大量地阻滯于G0/ G1期，抑制有絲分裂進程，同時具有明顯的細胞毒作用。⑤抑制腫瘤細胞的侵襲轉移：惡性腫瘤細胞有別于正常細胞和良性腫瘤細胞的主要原因是，前者能夠從原發部位經過血液和淋巴途徑，轉移到遠處的正常組織和器官，造成轉移播散進展。內皮血管生長因子過度表達是刺激腫瘤滋養血管生成的重要因子，基質金屬蛋白酶-2是重要的蛋白水解酶，與癌細胞突破外周組織基底膜向遠處侵襲轉移密切相關，已有研究證實[15]，在去甲斑蝥素作用于人膀胱癌T24細胞后，可以下調基質金屬蛋白酶-2和內皮血管生長因子的表達，降低膀胱癌的侵襲與轉移能力。還有學者[16]實驗證實，去甲斑蝥素能夠顯著抑制體外培養的皮膚鱗狀細胞癌A431細胞的體外黏附、侵襲和遷移能力，其機制可能與其能下調內皮血管生長因子和基質金屬蛋白酶-2蛋白表達水平相關。本次實驗發現去甲斑蝥素能夠誘導人雄激素非依賴型前列腺癌PC-3細胞的凋亡并干擾PC-3細胞的有絲分裂，進而對PC-3細胞增殖產生抑制作用，提示去甲斑蝥素或可成為治療AIPC的有效輔助藥物。去甲斑蝥素影響PC-3細胞周期并誘導其凋亡的詳細病理機制，還有待進一步實驗研究。