宮頸高危型人乳頭瘤病毒感染與陰道菌群及血清氧化應激水平關系探討

張送萍，尹凌凡，畢艷慧

北京中醫藥大學深圳醫院(深圳518172)

人乳頭瘤病毒(Human papilloma virus,HPV)是一種雙鏈DNA型病毒，常見于女性宮頸感染中，既往研究證實其中的持續高危型HPV(High-risk HPV,HR-HPV)感染是女性宮頸癌及癌前病變的高危因素，嚴重威脅女性身心健康與生活質量[1-3]。女性陰道是一個重要的微生態環境，容易受到病原菌入侵而發生感染，健康狀態下陰道微生態菌群處于動態平衡中，HPV感染后機體能通過自身免疫力將其清除，但也存在部分未被清除會持續感染宮頸部位，造成宮頸病變[4]。近年來關于HPV促進宮頸病變的具體過程機制成為研究熱點，目前同類研究主要方向在于感染后陰道菌群及局部免疫微環境的變化，有文獻指出HPV感染會造成機體高氧化應激狀態，這將為HR-HPV致病機制提供一些新思路[5-6]。氧化應激是指機體在遭受炎癥或感染等病理變化后氧化-抗氧化防御系統的失衡，它與各種疾病的發生均存在密切聯系，是較具代表性的生物標志物[7]。為探究HPV感染對陰道菌群及血清氧化應激狀態的影響，本文對112例生殖道感染女性進行宮頸陰道病原菌及血清生化物的檢測，并分析其關系，現報告如下。

資料與方法

1 一般資料 選取本院2017年9月至2019年8月有生殖道感染癥狀患者112例作為研究對象，年齡23～65歲，平均(45.18±8.11)歲。病例納入標準：所有患者均為已婚或有性生活史；均存在生殖道感染的癥狀，包括異味、瘙癢、白帶增多、性狀顏色異常、下腹疼痛、尿頻與尿痛等；均對此研究知情并同意。排除標準：伴有其他心、肝、腎等嚴重性器質性疾病者；伴有免疫性疾病史；伴有子宮切除史者；妊娠期與哺乳期婦女。本研究已通過醫院倫理委員會審批。

2 研究方法

2.1 陰道分泌物的采集與檢測：采用窺陰器暴露陰道部位后，用無菌棉拭子輕輕刮取陰道側壁，1根加入10%的KOH溶液進行胺試驗，若聞到有氨味或魚腥樣氣味，則初步判斷存在陰道炎，然后再將1根棉拭子加入生理鹽水中反復洗滌，采用懸滴濕片法直接進行滴蟲觀察，找到滴蟲即可確診為滴蟲性陰道炎，采用革蘭染色法在油鏡下觀察霉菌與細菌形態，找到霉菌即可確診為霉菌性陰道炎，而當線索細胞陽性比例>20%確診為細菌性陰道炎。

2.2 宮頸分泌物、脫落細胞的采集與檢測：采用窺陰器暴露宮頸部位后，先以無菌棉球擦去宮頸表面黏液，使用無菌棉拭子在宮頸管內旋轉停留幾秒取出，以1 ml無菌生理鹽水洗脫，使用實時熒光聚合酶鏈式擴增反應(Real-time polymerase chain reaction，RT-PCR)檢測衣原體、支原體與解脲脲原體感染情況；再使用無菌采樣刷在宮頸內順逆時針各旋轉3周，1支置入HPV檢測保存液中，采用PCR-反向點雜交法進行HPV分型檢測，另1支置入生理鹽水中進行離心，去上清后將下層沉淀移入肝素抗凝管中，采用流式細胞儀分析分泌物中CD4+T與CD8+T淋巴細胞比例，每個標本檢測3次取平均值。

2.3 血清氧化應激與炎性因子水平檢測：空腹抽取外周血，分離血清后采用全自動生化分析儀分析氧化應激水平及炎性因子濃度。氧化應激水平：采用總抗氧化能力檢測試劑盒檢測總氧化態(Total oxidation state，TOS)與總還原態(Total antioxidant state，TAS)，計算氧化應激指數(Oxidative stress index，OSI)，OSI=TOS(μmolH2O2Eq/L)/ TAS(mmol Trolox Eq/L)。炎性因子濃度：采用酶聯免疫吸附試劑盒檢測血清中γ干擾素(Interferon-γ,IFN-γ)、白介素2(Interleukin-2，IL-2)與白介素4(Interleukin-4，IL-4)的濃度，每個標本檢測3次取平均值。

結 果

1 HR-HPV感染情況 宮頸分泌物檢查結果顯示，112例患者中HR-HPV感染陽性患者47例(占41.96%)，其中HPV16亞型29例(61.70%)，HPV18亞型9例(19.15%)，HPV31亞型2例(4.26%)，HPV35亞型1例(2.13%)，HPV51亞型1例(2.13%)，HPV52亞型5例(10.64%)。

2 HR-HPV感染與陰道菌群的關系 HR-HPV陽性組衣原體、解脲脲原體與細菌性陰道炎檢出率明顯高于HR-HPV陰性組(P<0.05)，兩組間支原體、霉菌與滴蟲檢出率無統計學差異(P>0.05)，見表1。

表1 HR-HPV感染與陰道菌群的關系[例(%)]

3 HR-HPV感染與血清氧化應激及炎性因子水平的關系 HR-HPV陽性組TOS、OSI、IFN-γ與IL-2濃度明顯高于HR-HPV陰性組(P<0.05)，而HR-HPV陽性組TAS與IL-4濃度明顯低于HR-HPV陰性組(P<0.05)，見表2。

表2 HR-HPV感染與血清氧化應激及炎性因子水平的關系

4 HR-HPV感染與宮頸分泌物CD4+T與CD8+T淋巴細胞比例的關系 HR-HPV陽性組宮頸分泌物CD4+T淋巴細胞比例與CD4+T/CD8+T比值明顯低于HR-HPV陰性組(P<0.05)，兩組間CD8+T淋巴細胞比例無統計學差異(P>0.05)，見表3。

表3 HR-HPV感染與宮頸分泌物CD4+T與CD8+T淋巴細胞比例

5 HR-HPV感染的多因素Logistic回歸分析 先對分類變量賦值：HR-HPV陰性=0，HR-HPV陽性=1；細菌性未感染=0，細菌性感染=1 ；衣原體未感染=0,衣原體感染=1；支原體未感染=0,支原體感染=1；解脲脲原體未感染=0，解脲脲原體感染=1；霉菌未感染=0，霉菌感染=1；滴蟲未感染=0，滴蟲感染=1，進行多因素Logistic回歸分析。結果顯示，HR-HPV感染與衣原體、解脲脲原體感染率呈現獨立正相關關系(P<0.05)，與血清TOS、OSI、IFN-γ及IL-2濃度呈現獨立正相關關系(P<0.05)，與宮頸分泌物中CD4+T/CD8+T比值及血清TAS呈現負相關關系(P<0.05)，見表4。

表4 HR-HPV感染多因素Logistic回歸分析

討 論

HR-HPV持續感染宮頸會導致宮頸癌變，而宮頸癌是女性常見的惡性腫瘤，且有逐年年輕化趨勢，嚴重威脅著女性健康[8]。HPV主要傳播途徑為性傳播、母嬰傳播以及破損黏膜與皮膚的接觸性傳播等，據最新綜述報道接種HPV疫苗可以顯著降低HPV感染率，但目前疫苗普及率仍較低，且由于該疫苗的高成本限制了接種人群[9]。由于HPV感染致癌的特殊性，近年來關于HPV的研究仍為臨床研究的熱門話題，研究其致病機制有助于臨床尋求合理的診療對策。

本研究中納入的112例存在生殖道感染癥狀的女性中，經宮頸分泌物檢查結果顯示，HR-HPV感染陽性患者47例(占41.96%)，其中主要為HPV16亞型(61.70%)與HPV18亞型(19.15%)。HPV是一種長度為8000 bps的雙鏈DNA病毒，目前已分離出的類型多達200種，其中HR-HPV如HPV16亞型與HPV18亞型在宮頸感染中最為常見[10]。既往謝建萍等[11]對300例生殖道感染婦女進行檢查，HR-HPV感染者123例，感染率為41.0%，其中主要為HPV16亞型(56.9%)與HPV52亞型(13.8%)，總的HR-HPV感染率及HPV16亞型感染率相近，HPV52與HPV18感染率稍有不同，這可能是由于樣本基數不夠大導致。

本研究結果顯示，HR-HPV陽性組衣原體、解脲脲原體與細菌性陰道炎檢出率明顯高于HR-HPV陰性組，多因素分析后發現HR-HPV感染與衣原體、解脲脲原體感染率呈現獨立正相關關系。正常狀態下，女性陰道菌群處于一個動態平衡中，乳酸桿菌可以分泌乳酸來維持陰道的酸性環境，還可分泌細菌素、拮抗物質與其他活性物質黏附于陰道黏膜內，這些物質能破壞細菌生物膜，從而抵抗病原體入侵[12-13]。在受到感染與炎性等病理刺激時，陰道菌群會失去平衡[14]。HR-HPV感染后會協同其他病原體如細菌性陰道炎導致癌變，而這些病原體感染與HPV感染的先后順序難以辨明，可能相輔相成，相互促進[15]。進一步檢測發現HR-HPV陽性組宮頸分泌物CD4+T淋巴細胞比例與CD4+T/CD8+T比值明顯低于HR-HPV陰性組，回歸分析顯示HR-HPV感染與宮頸分泌物中CD4+T/CD8+T比值呈負相關關系，顯示HR-HPV感染破壞了宮頸有效的細胞免疫作用，促使局部免疫環境失調。沙眼衣原體與解脲脲原體感染后會吸附于生殖道黏膜，損傷黏膜上皮細胞，促使發生炎癥反應，使得局部pH升高，生殖道免疫屏障遭受破壞，病原菌容易入侵，增加了HPV感染概率；細菌性陰道炎發生后改變了陰道內菌群結構，乳酸桿菌比例會大幅減少，從而使得弱酸性環境遭受破壞，影響了HPV的清除速率，同時細菌代謝會產生具有致癌作用的亞硝基胺，增強了對HPV的易感性[16-17]。

本研究還發現HR-HPV陽性組血清TOS與OSI濃度明顯高于HR-HPV陰性組，而TAS明顯低于HR-HPV陰性組，提示HR-HPV感染患者有著更高的血清氧化應激程度。機體在與外界環境相互作用中會不斷產生活性氧自由基，這些活性氧與自由基大量存在時會損害人體的正常細胞，需要被及時清除，而負責清除這些物質的是機體的氧化-抗氧化防御系統，這個系統一旦失衡就會產生氧化應激損傷，導致衰老與疾病。HR-HPV感染后，引起活性氧的釋放，同時促進前氧化性細胞因子的分泌，導致細胞膜磷脂層的脂質過氧化，而這些過氧化物會跨膜引起膜轉運和線粒體呼吸鏈的功能紊亂，促使細胞凋亡，造成組織損傷[18]。Williams等[19]指出HPV基因產物會增加宿主細胞中的ROS水平，從而誘發的一系列氧化應激反應。Foppoli等[20]指出HPV可以調節宿主細胞的氧化還原穩態，以利于感染和腫瘤轉化。氧化應激與炎癥反應密切相關，亦互為促進，當機體發生炎癥反應時，會誘發氧化應激，而當處于高應激狀態時，則會進一步促進炎癥反應[20]。HR-HPV陽性組IFN-γ與IL-2濃度明顯高于HR-HPV陰性組，而HR-HPV陽性組IL-4濃度明顯低于HR-HPV陰性組。IFN-γ主要功能為促進Th1細胞的成熟，并抑制Th2細胞的活化，IL-2是機體免疫應答的關鍵性細胞因子，其表達有助于增強巨噬細胞的抗瘤活性，IL-4則具有拮抗IFN-γ與IL-2的作用，能促進淋巴母細胞分化成Th2，抑制殺傷細胞激活，HPV感染后血清中IL-2與IFN-γ水平上升，而IL-4水平下降[4]。多因素回歸分析發現，HR-HPV與血清TOS、OSI、IFN-γ及IL-2濃度呈現獨立正相關關系，與宮頸分泌物中血清TAS呈現負相關關系，再次驗證上述推測。

綜上所述，宮頸HR-HPV感染患者陰道衣原體與解脲脲原體感染率升高，感染部位局部免疫功能降低，而血清呈現高炎性因子水平與氧化應激狀態，均與HR-HPV感染密切相關，對于日后生殖道HPV感染的診治中或能帶來一些啟發。本研究的局限性在單中心研究，納入病例數有限，所以可能造成一定程度的偏倚，有待于日后聯合多中心進行大樣本的臨床試驗對此進行驗證。