西紅花苷通過抑制氧化應激和炎癥反應對糖尿病大鼠腎臟損傷的保護作用*

邢甜甜，單 偉

1.錦州醫科大學基礎醫學院解剖學教研室(錦州 121001)；2.遼寧省營口市經濟技術開發區中心醫院(營口 115007)

糖尿病腎病(Diabetic nephropathy，DN)以腎小球基底膜增厚、系膜基質增生等為特征，最終引起尿蛋白增加甚至腎功能衰竭[1-5]。Ye等[6-7]研究發現，氧化應激和炎癥改變對DN發展尤為關鍵。西紅花苷為中藥西紅花的提取物，因其抗炎、抗氧化、抗糖尿病等作用突出而備受關注[8]。研究[9]發現，老年大鼠腎臟病變時，可出現氧化應激和炎癥異常，西紅花苷腹腔注射給藥 4 周后血清腎功能指標、氧化參數、炎癥基因表達水平明顯下降，治療效果較好。然而，西紅花苷對DN的影響尚不清楚。因此，本研究擬觀察西紅花苷對DN大鼠腎臟的保護作用并探討相關機制，為研究DN的治療方案拓展思路。

材料與方法

1 實驗材料

1.1 實驗動物：雄性SD大鼠45只，體質量為200～240 g(購自錦州醫科大學)。

1.2 主要試劑和儀器：鏈脲佐菌素(Streptozotocin，STZ)；西紅花苷(批號：111588-200501)；核因子κB(Nuclear factor-κB,NF-κB)、腫瘤壞死因子-α(Tumor necrosis factor-α，TNF-α)及白介素-6(Interleukin-6，IL-6)一抗 (英國Abcam公司)；HE染色、超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase，SOD)、過氧化氫酶(Catalase，CAT)、丙二醛(Malondialdehyde，MDA)試劑盒及Western blot二抗；倒置顯微鏡(日本Olympus公司)；石蠟切片機(德國SLEE公司)。

2 研究方法

2.1 動物分組：取雄性SD大鼠30只，按55 mg/kg一次性腹腔注射STZ，72 h測血糖，將血糖濃度大于16.7 mmol/L的大鼠定為糖尿病模型并隨機分成糖尿病組和西紅花苷組(30 mg/kg)，每組15只。另取15只正常SD大鼠作為對照組。每天給藥1次，劑量依據文獻[9-10]及預實驗確定。12周后進行各項指標的檢測。

2.2 樣本制備：實驗過程中檢測大鼠空腹血糖，大鼠處死前取血離心后取上清-20 ℃凍存，待測血尿素氮(Blood urea nitrogen，BUN)、尿白蛋白/肌酐比值(Albumin/creatinine ratio，ACR)、血肌酐(Serum creatinine，Scr)。12周后，每組取5只大鼠，固定后取出腎臟進行石蠟切片，用于HE染色及免疫組化。每組另取5只大鼠活取腎臟，裂解后制備上清，-20 ℃保存，用于進行Western blot。每組另取5只大鼠活取腎臟制備100 g/L勻漿，-20 ℃保存，用于SOD、CAT、MDA含量檢測，均采用試劑盒檢測。

2.3 HE染色：①經2.2制備的切片脫蠟后PBS洗3次；②蘇木素浸染2 min，自來水沖洗；③滴加伊紅1 min；④脫水透明后封片，拍照觀察。

2.4 免疫組化染色檢測大鼠腎臟NF-κB表達：①2.2制備的切片于PBS洗滌4次；②3% H2O2室溫12 min，PBS洗滌3次；③3%血清室溫下封閉40 min，不洗；④滴加一抗NF-κB(1∶600)，4 ℃過夜， PBS洗滌3次；⑤滴加二抗，室溫30 min，PBS洗滌3次；⑥滴加鏈霉親和素-生物素-酶復合物，室溫下30 min，PBS洗滌3次；⑦DAB顯色后拍照，Image J軟件分析NF-κB表達陽性率。

2.5 Western blot檢測NF-κB、TNF-α及IL-6蛋白相對表達：①提取腎臟總蛋白，BCA法測蛋白濃度；②10% SDS-PAGE凝膠電泳后轉移至PVDF膜，以含1% BSA的TBST室溫封閉3 h；③加一抗4 ℃過夜，TBST洗滌5次；④加入HRP標記的二抗室溫2 h，TBST洗滌5次；⑤ECL試劑盒顯影，Image J軟件分析灰度值。

結 果

1 三組大鼠血糖、BUN、ACR、Scr比較 見表1。與對照組相比，糖尿病組血糖明顯升高(P<0.05)，BUN、ACR和Scr亦明顯升高(P<0.05)。而與糖尿病組相比，西紅花苷組血糖、BUN、ACR和Scr均不同程度下降(均P<0.05)。

表1 三組大鼠血糖、BUN、ACR、Scr比較

2 三組大鼠腎組織HE染色結果 見圖1。對照組腎組織形態規則。糖尿病組腎組織結構紊亂，腎小球水腫增大。與糖尿病組相比，西紅花苷組上述變化均有所改善。

3 三組大鼠腎臟SOD、CAT、MDA比較 見表2。與對照組相比，糖尿病組MDA含量明顯升高，SOD、CAT含量明顯降低(P<0.05)。而與糖尿病組相比，西紅花苷組MDA含量明顯降低，SOD、CAT含量明顯升高(P<0.05)。

表2 三組大鼠腎臟SOD、CAT和MDA比較

4 三組大鼠腎臟NF-κB蛋白表達比較 見表3(圖2)。與對照組相比，糖尿病組NF-κB表達明顯增加(P<0.05)。與糖尿病組相比，西紅花苷組NF-κB表達明顯降低(P<0.05)。

5 Western blot檢測結果 見表3(圖3)。與對照組相比，糖尿病組NF-κB、TNF-α及IL-6表達明顯增加(P<0.05)。與糖尿病組相比，西紅花苷組NF-κB、TNF-α及IL-6表達明顯降低(P<0.05)。

表3 三組大鼠腎臟NF-κB、TNF-α及IL-6蛋白相對表達比較(%)

圖3 Western blot檢測NF-κB、TNF-α及IL-6蛋白相對表達

討 論

DN是一種以腎小球系膜和腎間質組織損傷為特征的進行性、不可逆性腎臟疾病。氧化應激和炎癥反應為DN發病的中心因素[11-12]。氧化應激失衡時會引起腎臟SOD、CAT和MDA含量的改變[13]。SOD對活性氧的清除只有在CAT的作用下才有效，因為CAT可進一步清除SOD產生的過氧化氫。這些酶之間的平衡對于有效清除細胞內器官中的氧自由基非常重要[14]。

本研究檢測了腎臟勻漿中SOD、CAT和MDA的含量，用來評價大鼠腎臟抗氧化平衡。發現糖尿病組腎組織勻漿中MDA含量升高，SOD和CAT含量降低，提示DN狀態下腎組織勻漿中的氧化狀態失衡。而經過西紅花苷治療后能降低MDA含量，升高SOD和CAT含量，同時血糖、BUN、ACR及Scr等血清學指標均明顯下降，說明西紅花苷可調節血糖及提高抗氧化能力，發揮對DN大鼠腎臟損傷的保護作用。Jnaneshwari等[15]報道通過對Wistar大鼠腹腔注射環磷酰胺造成內源性ROS升高，引起氧化失衡狀態，西紅花苷(10 mg/kg)口服給藥 6 d 后上述病理學改變可明顯改善。Shirali 等[8]應用西紅花苷對STZ誘導的 2 型糖尿病大鼠治療5個月后，發現大鼠狀態明顯好轉，毛色更加潔白光亮，且血糖水平及氧化應激反應明顯降低。以上數據均表明西紅花苷對糖尿病均有較好的治療效果，與本研究結果相一致。另有研究[16-17]發現，DN也與促炎細胞因子的增加有關。為了揭示西紅花苷抗DN過程中腎損傷的確切機制，我們研究了其對炎癥途徑的影響。DN過程中腎臟損傷的異常炎癥反應導致細胞因子和趨化因子的產生，進而促進了炎癥的分子途徑[18]。Ayepola等[19]研究表明，在腎損傷疾病中促炎介質的顯著增加證明器官損傷和功能障礙的嚴重程度與促炎介質的水平呈正相關。Malik等[20]發現，DN狀態下腎組織中NF-κB、TNF-α、IL-6水平明顯升高。然而，應用西紅花苷后，炎癥因子均明顯降低。這說明西紅花苷可減輕與DN相關的腎損傷，參與抑制分子炎癥途徑。結果提示，對DN大鼠給予西紅花苷對預防腎功能損傷具有良好的保護作用，至少部分是通過改善炎癥信號通路實現的。

綜上所述，我們證明西紅花苷可有效緩解DN過程中的大鼠腎臟損傷。這種保護作用表現為改善腎臟損傷時血清相關指標、氧化/抗氧化失衡和抑制分子炎癥途徑。當然，DN發病機制復雜，西紅花苷對DN大鼠腎臟損傷的防治效果有待進一步深入探討。