尿激酶、低分子肝素對膿毒癥彌散性血管內凝血大鼠模型的影響研究*

尤金枝，王捷虹，高麥倉，王瑞哲，任耀龍，王晨曦，王 博，梁嘉斌，劉 旺，于 勇

陜西中醫藥大學附屬醫院(咸陽712000)

膿毒癥是由感染引起的宿主反應失調，可導致危及生命的器官功能障礙[1-3]。每年約有1800萬人罹患膿毒癥[4]，而膿毒癥休克是急危重癥醫學領域的棘手問題[5]，是重癥醫學科危重病患者的首要死因[6]，臨床病死率高[7-8]。膿毒癥導致的彌散性血管內凝血(Diffuse intravascular coagulation，DIC)占發病總數的25%～50%，如何有效防治膿毒癥所致DIC很有研究價值。基于此，我們進行尿激酶(Urokinase，UK)及低分子肝素(Low molecular weight heparin，LMWH)對膿毒癥DIC大鼠模型的干預效應研究，為臨床規范應用提供實驗支撐和理論依據。

材料與方法

1 研究材料

1.1 動物及分組：健康SD大鼠100只，雌雄各半(排除孕鼠)，體質量180～200 g，周齡7～8周。將動物隨機分為六組：生理鹽水(Normal saline，NS)對照組30只，分為NS(1 h)、NS(2 h)、NS(4 h)三個亞組，各10只；脂多糖(Lipopolysaccharide，LPS)造模組30只，分為LPS(1 h)、LPS(2 h)、LPS(4 h)三個亞組，各10只；尿激酶組(UK)10只；脂多糖造模+尿激酶組(LPS+UK)10只；低分子肝素組(LMWH)10只；脂多糖造模+低分子肝素組(LPS+LMWH)10只。

1.2 藥物：低分子量肝素鈣注射液(國藥準字H20163060)，注射用尿激酶(國藥準字H32021989)，戊巴比妥。

1.3 試劑和儀器：血漿凝血酶原時間(Prothrombin time，PT)、活化部分凝血酶原時間(Activated partial prothrombin time，APTT)、纖維蛋白原(Fibrinogen，FBG)、D-二聚體(D-dimer，DD)、血小板(Platelet，PLT)試劑，內毒素；全自動凝血分析儀(深圳雷杜生命科學股份有限公司， RAC-1800)，電子分析天平(上海佑科儀器儀表有限公司， FA2004B)，離心機(德國Thermo Fisher Scientific公司，75002440)，移液槍(德國艾本德股份公司，Eppendorf AG)，全自動正置顯微鏡(日本Nikon eclipse，90i)。

2 研究方法 實驗前空腹12 h，1%戊巴比妥(30 mg/kg)經腹腔麻醉后按分組用微量泵經尾靜脈輸入生理鹽水或藥物。與NS組比較，同時存在以下三項以上異常，即判斷造模成功： PT延長3 s以上； APTT延長5 s以上；FBG下降超過25%； PLT明顯降低； DD明顯升高；器官組織切片顯示微血管中出現纖維蛋白微血栓。輸注方法：①NS組：NS 2.5 ml/h×4 h；②UK組：NS 2.5 ml/h，在輸注1 h后，加入UK 10 IU/(g·h)×3 h；③LPS組：LPS 30 mg/(kg·h)×4 h；④LPS+UK組：LPS 30 mg/(kg·h)，在輸注1 h后，加入UK 10 IU/(g·h)×3 h；⑤LMWH組：NS 2.5 ml/h，輸注1 h后加入LMWH 50 IU/(g·h)×3 h；⑥LPS+LMWH組：LPS 30 mg/(kg·h)，輸注1 h后加入LMWH 50 IU/(g·h)×3 h。NS和LPS亞組分別于輸注后1 h、2 h、4 h，UK、LPS+UK、LMWH、LPS+LMWH各組分別于輸注后4 h，經腹腔靜脈采集血樣，血液標本一部分以3000 r/min離心15 min，取上清液置于-20 ℃冰箱內保存、備測，另一部分以3.8%枸櫞酸鈉1∶5抗凝或EDTA抗凝待測。

3 觀察指標 對比各組PT、APTT、PLT、DD、FBG、纖維蛋白原降解產物(Fibrinogen degradation product，FDP)及出血率。

4 統計學方法 采用SPSS 23.0統計學軟件對數據進行分析。計量資料以均數±標準差表示，采用t檢驗。計數資料以例(%)表示，采用χ2檢驗。P<0.05表示差異具有統計學意義。

結 果

1 輸注LPS后凝血及纖溶指標變化情況 見表1。隨著輸注時間的延長，與NS組比較，LPS組PT、APTT逐漸延長，DD逐漸增加，FBG、PLT逐漸降低。這種變化在輸注1 h開始出現，2 h達高峰，在2～4 h呈平臺趨勢，表明LPS持續泵入1 h后即可達到膿毒癥DIC的診斷標準。

表1 LPS組與NS組凝血及纖溶指標比較

2 UK、LMWH干預前后凝血及纖溶指標變化 見表2。與NS(4 h)組比較，UK組和LMWH組PT、APTT延長(均P<0.05)，而FBG、FDP、DD、PLT改變不明顯(P>0.05)，且UK組較LMWH組 PT、APTT延長更明顯，但無統計學差異(P>0.05)；LPS(4 h)組PT、APTT延長，FBG、PLT下降，DD升高。與LPS(4 h)組相比較，LPS+UK組和LPS+LMWH組PT、APTT縮短，FBG、FDP、PLT升高，DD下降(P<0.05)，但未恢復到NS組水平，提示UK、LMWH可改善DIC模型大鼠凝血及纖溶功能。

表2 各組給藥后凝血及纖溶指標比較

3 出血率比較 見表3。在研究過程中，UK組和LPS+UK組7只大鼠出現了瞼結膜充血、腹部皮膚青紫及肺出血的情況，而LPS組和LPS+LMWH組大鼠未出現類似情況，LMWH組和LPS+LMWH組與NK組和LPS+UK組出血率比較，差異有統計學意義(P<0.05)，表明LMWH較UK更安全。

表3 UK組和LPS+UK組與LMWH組和LPS+LMWH組出血率比較[例(%)]

討 論

膿毒癥是ICU患者主要死因[9]。近年來，隨著對膿毒癥發病機制的研究不斷深入，逐漸認識到膿毒癥是感染病原體與宿主免疫系統、炎癥反應、凝血反應之間相互作用，相繼啟動炎性細胞，損傷內皮細胞，啟動凝血，從而形成一整套造成機體器官功能損害的復雜臨床綜合征[10]，機體炎癥反應失衡和凝血系統功能紊亂都是膿毒癥發病的重要機制的中間環節，而兩者之間的相互作用關系更是臨床DIC以及進一步發展為多器官功能障礙綜合征的重要標志之一[11]。DIC是膿毒癥發生、發展的關鍵環節[12]，隨著病情進展，合并DIC的膿毒癥，其病死率高[13]。因此，正確評估膿毒癥嚴重程度，嚴密監測凝血功能，早期發現并及時干預DIC，對患者預后具有非常重要的意義。在膿毒癥中，凝血啟動與炎癥反應的交叉、微血栓的形成需要采用抗凝劑治療，以避免各種因子出現瀑布樣激發，從而減弱器官功能障礙及損傷。目前，部分國內外學者致力于研究適于臨床廣泛應用且安全有效的抗凝劑，以治療嚴重膿毒癥。重癥感染患者早期應用抗凝劑治療可能會受益[14]。袁凱鋒等[15]研究表明，尿激酶對改善LPS誘導的Wistar大鼠DIC模型出現的凝血及纖溶異常、器官功能障礙具有積極作用。而對于高危患者合并DIC但無出血癥狀者，推薦使用預防劑量肝素或小劑量低分子肝素[16]。段圣潔等[17]研究表明，新生兒膿毒癥合并DIC采用低分子肝素治療，抗凝效果顯著，安全性高。

盡管對于凝血功能紊亂和炎癥反應在膿毒癥并DIC中發病機制的研究取得了一定的進展，但對于初期凝血功能紊亂的檢查手段非常有限，無法尋得真正有效的解決途徑。在之前的臨床研究中，我們在排除禁忌證的情況下，對于膿毒癥患者及時予以UK或LMWH治療[18]，療效確切，但其作用機制有待在實驗動物模型上進行更深入的研究。基于此，我們進行UK及LMWH對膿毒癥DIC大鼠模型的干預效應研究，通過建立膿毒癥DIC大鼠模型，檢測凝血指標、纖溶指標等，分析其對微循環障礙及纖溶活性的作用，考察UK、LMWH對膿毒癥DIC大鼠模型的影響。在LPS持續泵入1 h后，即達到膿毒癥DIC的診斷標準，表明造模成功；隨著輸注時間的延長，與NS組比較，LPS組PT、APTT逐漸延長，DD逐漸增加，FBG、PLT逐漸降低；經UK、LMWH干預后，PT、APTT縮短，FBG、PLT升高，DD下降，與LPS組比較，差異具有統計學意義；LMWH組和LPS+LMWH組的出血率低于NK組和LPS+UK組，差異具有統計學意義。本研究結果表明，UK和LMWH均可防治膿毒癥DIC。然而，因為DIC分為高凝期、消耗性低凝期、繼發性纖溶亢進期，因此對于無抗凝禁忌證的膿毒癥并發DIC高凝期患者，可早期應用抗凝劑(尿激酶或低分子肝素)，對預防DIC形成有積極意義，其通過改善微循環并干預纖溶活性而發揮防治DIC的作用。另外，UK對于已形成的血栓有溶栓作用，但高劑量的UK可能增加出血風險[19]，對于防治DIC、改善微循環，LMWH可能是更安全的選擇。