不同硬化劑治療后兔血管內(nèi)皮及其周圍組織病理變化*

劉翔宇，魏 志，孫自勤

1.山東省濟(jì)寧市第一人民醫(yī)院消化內(nèi)科(濟(jì)寧272000)；2.山東省立醫(yī)院西院區(qū)消化內(nèi)科(濟(jì)南 250031)；3.中國(guó)人民解放軍聯(lián)勤保障部隊(duì)第九六零醫(yī)院消化內(nèi)科(濟(jì)南 250031)

食管胃靜脈曲張(Gastroesophageal varices，GOV)約見于50%肝硬化患者，是肝硬化門脈高壓癥的常見并發(fā)癥之一[1-2]。食管胃靜脈曲張破裂出血(Esophagogastric variceal bleeding，EVB)患者病死率高，是消化系統(tǒng)的急危重癥之一[3-4]。目前內(nèi)鏡下治療食管胃靜脈曲張的方法主要有內(nèi)鏡下硬化劑注射治療和內(nèi)鏡下曲張靜脈套扎術(shù)。常用于GOV治療的硬化劑為聚桂醇注射液[4-5]。近年來，泡沫硬化劑也逐漸得到了大家的重視，目前在下肢靜脈曲張、血管畸形的治療中已廣泛應(yīng)用[6-7]，但是在GOV的治療中應(yīng)用較少。本研究通過觀察不同硬化劑、不同注射方式以及不同時(shí)點(diǎn)下實(shí)驗(yàn)動(dòng)物血管壁及其周圍組織病理變化情況，為臨床選擇硬化劑、治療方式提供理論依據(jù)。

材料與方法

1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 普通級(jí)新西蘭大白兔86只，2月齡，雌雄不限，體質(zhì)量2～2.5 kg，按實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用的3R原則給予人道關(guān)懷。

2 實(shí)驗(yàn)試劑 聚桂醇注射液(國(guó)藥準(zhǔn)字H20080445)和血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(Vascular endothelial growth factor，VEGF)鼠單克隆抗體等。

3 實(shí)驗(yàn)方法

3.1 動(dòng)物分組：取兔耳緣靜脈171支，分為聚桂醇組(81支)、泡沫硬化劑組(81支)和生理鹽水組(9支)。①聚桂醇組：又分為血管內(nèi)注射(27支，聚桂醇注射液0.2～0.3 ml血管內(nèi)注射，不壓迫血管)、血管旁注射(27支，聚桂醇注射液0.1 ml血管旁皮下多點(diǎn)注射)和聯(lián)合注射(27支，聚桂醇注射液0.2～0.3 ml血管內(nèi)注射，0.1 ml血管旁皮下多點(diǎn)注射)。②泡沫硬化劑組：將聚桂醇注射液與空氣按1∶4比例混合制備泡沫硬化劑[8-11]。注射方式以及劑量同聚桂醇組。③生理鹽水組：生理鹽水0.2～0.3 ml血管內(nèi)注射，不壓迫血管。

3.2 標(biāo)本制作及觀察分析：分別于注射后0.5 h、1 h、3 h、6 h、12 h、24 h、72 h、120 h、168 h取兔耳緣靜脈及血管周圍組織作為標(biāo)本。所有標(biāo)本均固定、包埋，進(jìn)行HE染色和免疫組化染色。對(duì)蠟塊連續(xù)切片各5張，在高倍鏡(10×40倍)下隨機(jī)選取5個(gè)非重合的視野進(jìn)行觀察，棕黃色或黃色為陽性細(xì)胞。采用Biosens Digital Imaging System V1.6圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行VEGF光密度分析，取平均值。

結(jié) 果

1 聚桂醇組注射后的組織病理學(xué)變化

1.1 HE染色：注射聚桂醇注射液3 h后，兔耳緣靜脈均出現(xiàn)血管內(nèi)皮細(xì)胞增生、排列紊亂，伴少量炎細(xì)胞浸潤(rùn)。24 h后，內(nèi)皮細(xì)胞破壞，血管周圍組織細(xì)胞出現(xiàn)輕度水腫，聯(lián)合組較其他兩組更明顯。72 h后，出現(xiàn)血小板聚集伴明顯炎細(xì)胞浸潤(rùn)。120 h后，血小板呈網(wǎng)格狀聚集，內(nèi)充紅細(xì)胞，血栓開始機(jī)化。168 h后，血管壁及血管周圍纖維化，血栓機(jī)化，聯(lián)合組出現(xiàn)更早。見圖1。

1.2 免疫組化染色：VEGF平均光密度在不同注射方式下均表現(xiàn)為先上升后下降，其上升峰值出現(xiàn)在注射后72 h。聯(lián)合注射上升更明顯，血管旁注射次之。相同注射方式下各時(shí)段間比較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。同時(shí)段不同注射方式間比較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。同時(shí)段不同注射方式間兩兩比較，血管內(nèi)注射與血管旁注射、聯(lián)合注射相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；血管旁注射與聯(lián)合注射相比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.095)。見表1(圖2)。

表1 聚桂醇組各時(shí)段VEGF平均光密度

2 泡沫硬化劑組注射后的組織病理學(xué)變化

2.1 HE染色：病理變化與聚桂醇組基本一致，但炎癥反應(yīng)較聚桂醇組輕微(圖3)。

2.2 免疫組化染色：VEGF平均光密度變化趨勢(shì)與聚桂醇組基本相似，峰值也出現(xiàn)在注射后72 h。聯(lián)合注射上升趨勢(shì)更明顯，血管旁注射次之。相同注射方式下各時(shí)段比較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。同時(shí)段不同注射方式間比較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。同時(shí)段不同注射方式間兩兩比較，血管內(nèi)注射與血管旁注射、聯(lián)合注射相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；血管旁注射與聯(lián)合注射相比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.095)。見表2(圖4)。

3 生理鹽水組注射后的組織病理學(xué)變化 HE染色下，鏡下未發(fā)現(xiàn)血管壁損傷及血栓形成。免疫組化染色下，VEGF平均光密度各時(shí)段比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

表2 泡沫硬化劑組各時(shí)段VEGF平均光密度

4 相同注射方式下不同硬化劑組間VEGF平均光密度兩兩比較

4.1 血管內(nèi)注射：聚桂醇組分別與泡沫硬化劑組和生理鹽水組比較，泡沫硬化劑組與生理鹽水組比較，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

4.2 血管旁注射：聚桂醇組與泡沫硬化劑組比較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

4.3 聯(lián)合注射：聚桂醇組與泡沫硬化劑組比較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

討 論

自Cassaigness于1853年首先提出硬化劑療法以來，采用硬化劑治療靜脈曲張已有150多年的歷史。泡沫硬化劑的概念在1944年由Orbach最先提出。目前在下肢靜脈曲張的治療中，多已采用泡沫硬化劑。有研究[12]表明，泡沫硬化劑與液體硬化劑相比效果更好，但副作用沒有明顯增加。

為了解不同注射方式及不同硬化劑注射后血管內(nèi)皮細(xì)胞的變化及血管周圍的微血管增生情況，本研究選擇VEGF的表達(dá)進(jìn)行研究，對(duì)HE染色及免疫組化結(jié)果綜合分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)注射聚桂醇注射液后VEGF的表達(dá)表現(xiàn)為先上升后下降，注射后72 h表達(dá)最高；各時(shí)段之間比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。不同注射方式間比較，聯(lián)合注射上升最快，VEGF表達(dá)最高，下降較緩慢，血管旁注射次之，血管內(nèi)注射最低。各注射方式間比較，VEGF表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；兩兩比較時(shí)，血管內(nèi)注射VEGF表達(dá)與血管旁注射、聯(lián)合注射比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但血管旁注射和聯(lián)合注射比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

有文獻(xiàn)[13-14]報(bào)道，聚桂醇注射液以黏膜下注射為主，因?yàn)殪o脈旁注射引起周圍組織水腫及炎癥的作用迅速，并促進(jìn)成纖維母細(xì)胞的增生，而黏膜下注射基本不破壞血管內(nèi)皮，且不易形成血栓。同時(shí)，在本研究中血管旁注射和聯(lián)合注射中均發(fā)現(xiàn)血管周圍大量成纖維細(xì)胞增生。張春榮等[15]在SD大鼠氣管黏膜下注射1%乙氧硬化醇0.05 ml后，分別于第1、3、5、7天行VEGF免疫組化染色及電鏡觀察，結(jié)果發(fā)現(xiàn)黏膜下層VEGF的表達(dá)增加，其表達(dá)在第3～5天達(dá)到最高峰，且電鏡下觀察發(fā)現(xiàn)第3天開始細(xì)胞周圍的膠原纖維較以往增多，第5天膠原纖維增生明顯且排列整齊，第7天膠原纖維排列致密，本研究中VEGF表達(dá)的變化過程與其相一致。

與液體硬化劑相比，泡沫硬化劑具有其獨(dú)特的優(yōu)點(diǎn)[16-18]：首先，泡沫使其與血管內(nèi)膜的接觸面積增大，在相同劑量下可以達(dá)到更好的效果；其次，泡沫硬化劑易于分布在血管內(nèi)皮表面，可使其與血管的接觸時(shí)間延長(zhǎng)；最后，泡沫硬化治療可以在超聲引導(dǎo)下進(jìn)行。本研究發(fā)現(xiàn)，泡沫硬化劑注射后血管病理變化與聚桂醇注射液基本一致，但是血管內(nèi)損傷、炎癥情況都較聚桂醇注射液輕微。因此，雖然兩種硬化劑均具有血管損傷輕、硬化止血效果好、組織修復(fù)快等優(yōu)點(diǎn)，都可以供臨床選擇。但泡沫硬化劑的血管損傷更輕微，周圍組織恢復(fù)更快，應(yīng)作為首選的硬化劑。

在注射方式的選擇方面，楊培生等[19]在研究大鼠的股靜脈在不同硬化劑注射后的病理變化時(shí)發(fā)現(xiàn)，血管內(nèi)注射和黏膜下層注射聯(lián)合應(yīng)用時(shí)可以發(fā)揮其相互協(xié)同的作用：①可以減少注入血管的硬化劑的量；②血管旁注射后血管受到擠壓，可以使血管壓力下降。本研究中，聯(lián)合注射在組織學(xué)和VEGF平均光密度的趨勢(shì)上明顯優(yōu)于血管內(nèi)注射及血管旁注射，故聯(lián)合注射可作為首選的注射方法。

綜上所述，聚桂醇及其制備的泡沫硬化劑都是理想的硬化劑。與聚桂醇注射液相比，泡沫硬化劑具有血栓形成快、組織損傷小、組織修復(fù)快等優(yōu)點(diǎn)。在注射方式上血管內(nèi)聯(lián)合血管旁注射更具有優(yōu)勢(shì)。