羅清勇 馮鵬 張宗平

前列腺癌占全球所有癌癥病例的12%，是男性中第二常見的癌癥[1]。對于前列腺癌的治療，主要使用放射療法或根治性前列腺切除術(shù)和激素消融療法，然而，這些方法不能提高患者的存活率，并且近30%的患者經(jīng)歷了根治性前列腺切除術(shù)后復(fù)發(fā)[2]，因此，與前列腺癌發(fā)生相關(guān)分子機制的全面表征是十分必要的[3]，有助于提高患者的生存和增加當(dāng)前治療選擇。微小RNA(microRNA，miRNA/miR)是轉(zhuǎn)錄后調(diào)控基因表達的小型非編碼RNA，是非編碼基因組的一部分。大量數(shù)據(jù)表明，miRNA是許多疾病(包括癌癥)的潛在生物標(biāo)志物，其異常表達與前列腺癌的潛在機制有關(guān)[4,5]。有研究用miRNA芯片技術(shù)對正常前列腺組織和前列腺癌組織進行篩選，發(fā)現(xiàn)miR-320e在前列腺癌組織中的表達明顯上調(diào)[6,7]，并發(fā)現(xiàn)miR-320e高表達可增強胰腺癌細(xì)胞耐藥性、促進細(xì)胞增殖[8]，但miR-320e對前列腺癌細(xì)胞生物學(xué)行為的影響及其機制尚不清楚。基于此，本研究以體外培養(yǎng)的前列腺癌細(xì)胞DU145為對象，評價miR-320e在前列腺癌細(xì)胞增殖和凋亡中的作用，并利用生物學(xué)信息預(yù)測其可能的靶基因脆性組氨酸三聯(lián)體(fragile histidine triad，F(xiàn)HIT)，旨在揭示miR-320e影響前列腺癌細(xì)胞增殖和凋亡的相關(guān)機制。

1 材料與方法

1.1 主要試劑 前列腺癌細(xì)胞DU145和前列腺正常上皮細(xì)胞RWPE-1購自中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞資源中心，RPMI1640培養(yǎng)基、胎牛血清購自美國Hyclone公司，噻唑藍(methyl thiazolyl tetrazolium，MTT)、RIPA裂解液購自美國Sigma公司，miR-320e、anti-miR-320e、pcDNA3.1-FHIT、si-FHIT、雙熒光素酶載體購自上海GenePharma公司，TRIzol、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、Lipofectamine 2000購自美國Invitrogen公司，qPCR試劑盒購自日本TaKaRa公司，SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液、雙螢光素酶報告基因檢測試劑盒購自上海碧云天生物技術(shù)研究所，聚偏二氟乙烯(polyvinylidene fluoride，PVDF)膜購自美國Millipore公司，甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)、細(xì)胞周期蛋白D1(CyclinD1)、P21、B細(xì)胞淋巴瘤/白血病-2(B cell lymphoma/lewkmia-2，Bcl-2)、Bcl-2相關(guān)X蛋白(Bcl-2 associated X protein，Bax)蛋白抗體購自美國Cellular Signaling Technology公司，F(xiàn)HIT抗體購自Abcam公司，辣根過氧化物酶標(biāo)記二抗購自博士德生物公司，Annexin V-FITC/PI細(xì)胞凋亡檢測試劑盒購自江蘇凱基生物公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng) DU145和RWPE-1細(xì)胞復(fù)蘇后，加入含10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基，放在73℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每周換液2～3次。細(xì)胞密度為70%左右時，使用胰酶消化、傳代。

1.3 實時熒光定量PCR(quantitative real-time polymerase chain reaction,qPCR)檢測miR-320e表達 利用TRIzol試劑提取DU145和RWPE-1細(xì)胞總RNA，按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書的指示，合成cDNA，在ABI 7500熒光定量PCR儀中檢測miR-320e水平，收集Ct值，以2-ΔΔCt法計算miR-320e表達量。miR-320e正向引物序列5’-GGCCTTCTCTTCCCAGTTCTT-3’，反向引物序列5’-TCACCTTCTCAACCCAGCTTT-3’。內(nèi)參U6正向引物序列5’-GCTTCGGCAGCACATATACTAAAAT-3’，反向引物序列5’-CGCTTCACGAATTTGCGTGTCAT-3’。

1.4 細(xì)胞轉(zhuǎn)染 選取處于對數(shù)生長期的DU145細(xì)胞，以1×105個/ml的密度接種于6孔板。細(xì)胞密度為約70%時，根據(jù)Lipofectamine 2000試劑說明書，將miR-320e、anti-miR-320e、pcDNA3.1-FHIT、si-FHIT和相應(yīng)的陰性對照轉(zhuǎn)染入DU145細(xì)胞，轉(zhuǎn)染4～6 h，更換為含10%胎牛血清的新鮮培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，備用。

1.5 靶基因預(yù)測及雙熒光素酶報告基因?qū)嶒?TargetScan網(wǎng)站(http://www.targetscan.org/)預(yù)測發(fā)現(xiàn)FHIT的3’非編碼區(qū)(3’untranslated region，3’UTR)部分堿基可與miR-320e形成互補配對。為了證實miR-320e與FHIT的靶向關(guān)系，分別構(gòu)建含有miR-320e結(jié)合位點的野生型FHIT(WT- FHIT)和突變型(MUT- FHIT)3’UTR熒光素酶報告載體，并分別與miR-320e或anti-miR-320e共轉(zhuǎn)染，培養(yǎng)48h后，檢測雙熒光素酶活性。

1.6 蛋白質(zhì)印跡法(Western blot)檢測目的蛋白表達 為檢測目的蛋白表達，使用RIPA裂解液充分提取DU145細(xì)胞總蛋白，取等量蛋白樣品上樣，經(jīng)10%的SDS-PAGE分離蛋白，轉(zhuǎn)移到PVDF膜，室溫條件下5%脫脂奶粉封閉1 h，加入CyclinD1、P21、Bcl-2、Bax、FHIT蛋白一抗(稀釋度為1∶1 000)，4℃條件下孵育過夜，次日用Tris-HCl-Tween緩沖鹽溶液(Tris buffered saline with Tween,TBST)洗膜15 min，漂洗3次，加入二抗(稀釋度為1∶5 000)，室溫條件下孵育1 h，TBST洗膜15 min，漂洗3次，加入化學(xué)發(fā)光液顯影，以GAPDH作為內(nèi)參，分析CyclinD1、P21、Bcl-2、Bax、FHIT蛋白表達。

1.7 MTT法檢測細(xì)胞增殖 DU145細(xì)胞按5×104個/ml的密度接種于96孔板，在培養(yǎng)箱中分別孵育24 h、48 h、72 h，培養(yǎng)結(jié)束后，每孔加入20 μl MTT溶液(5 mg/ml)，培養(yǎng)箱孵育4 h，加入150 μl二甲基亞砜，37℃搖床震蕩10 min，酶標(biāo)儀讀取DU145細(xì)胞吸光值(波長為490 nm)，以吸光值表示細(xì)胞活性(490 nm)。

1.8 細(xì)胞凋亡實驗 細(xì)胞凋亡率的檢測依據(jù)Annexin V-FITC/PI 細(xì)胞凋亡檢測試劑盒說明書的步驟進行。轉(zhuǎn)染后的DU145細(xì)胞使用胰酶消化，離心收集1×105個細(xì)胞，加入500 μl緩沖液使細(xì)胞懸浮，加入5 μl Annexin V-FITC混勻，加入5 μl PI混勻，避光反應(yīng)15 min，進行流式細(xì)胞儀的觀察和檢測。

2 結(jié)果

2.1 miR-320e在前列腺正常上皮細(xì)胞RWPE-1和前列腺癌細(xì)胞DU145中的表達 qPCR檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與前列腺正常上皮細(xì)胞RWPE-1相比，前列腺癌細(xì)胞DU145中miR-320e表達量明顯升高(P<0.05)。見表1。

表1 miR-320e在細(xì)胞RWPE-1和細(xì)胞DU145中的表達

2.2 抑制miR-320e表達對細(xì)胞DU145增殖、凋亡的影響 在DU145細(xì)胞中轉(zhuǎn)染anti-miR-320e，miR-320e表達量遠低于anti-miR-NC組(P<0.05)，表明成功構(gòu)建抑制miR-320e表達的細(xì)胞。MTT檢測細(xì)胞DU145增殖，數(shù)據(jù)顯示，抑制miR-320e表達較anti-miR-NC組明顯降低DU145細(xì)胞24 h、48 h、72 h時的細(xì)胞活性(P<0.05)。流式細(xì)胞術(shù)檢測結(jié)果表明，抑制miR-320e表達較anti-miR-NC組明顯增加細(xì)胞DU145的凋亡率(P<0.05)。Western blot測定增殖、凋亡相關(guān)蛋白表達，發(fā)現(xiàn)與anti-miR-NC組比較，抑制miR-320e表達明顯減少Cyclin D1、Bcl-2蛋白表達量，顯著提高P21、Bax蛋白水平(P<0.05)。見圖1，表2、3。

圖1 抑制miR-320e表達對細(xì)胞DU145增殖、凋亡的影響;A：抑制miR-320e表達對細(xì)胞DU145凋亡的影響;B：抑制miR-320e表達對細(xì)胞DU145增殖、凋亡蛋白表達的影響

表2 抑制miR-320e表達對細(xì)胞DU145增殖、凋亡的影響

表3 抑制miR-320e表達對細(xì)胞DU145增殖、凋亡蛋白表達的影響

2.3 miR-320e靶向調(diào)控FHIT的表達 生物信息學(xué)預(yù)測結(jié)果顯示，F(xiàn)HIT的3’UTR含有與miR-320e互補的核苷酸序列，提示FHIT可能是miR-320e的下游靶基因。雙熒光素酶報告實驗進行驗證，結(jié)果表明，與miR-NC和WT- FHIT共轉(zhuǎn)染比較，miR-320e和WT- FHIT共轉(zhuǎn)染明顯降低DU145細(xì)胞的雙熒光素酶相對活性(P<0.05)，而與miR-NC、miR-320e分別與MUT- FHIT共轉(zhuǎn)染后，DU145細(xì)胞的雙熒光素酶相對活性無明顯變化。Western blot檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)，同miR-NC組相比，miR-320e組FHIT蛋白表達量明顯減少(P<0.05)，anti-miR-320e組FHIT蛋白表達量比anti-miR-NC組顯著增加(P<0.05)。見圖2，表4、5。

圖2 miR-320e靶向調(diào)控FHIT；A FHIT的3’UTR含有miR-320e的互補序列;B miR-320e調(diào)控FHIT的表達

表4 雙熒光素酶報告實驗

表5 miR-320e調(diào)控FHIT的表達

2.4 過表達FHIT對細(xì)胞DU145增殖、凋亡的影響 將pcDNA3.1-FHIT轉(zhuǎn)染入細(xì)胞DU145，發(fā)現(xiàn)FHIT蛋白表達量明顯高于pcDNA3.1組(P<0.05)，說明過表達FHIT的DU145細(xì)胞構(gòu)建成功。與pcDNA3.1組相比，過表達FHIT明顯降低24 h、48 h、72 h的細(xì)胞活性(P<0.05)，增加細(xì)胞凋亡率(P<0.05)，減少Cyclin D1、Bcl-2蛋白表達量，而提高P21、Bax蛋白水平(P<0.05)。見圖3，表6、7。

圖3 過表達FHIT對細(xì)胞DU145增殖、凋亡蛋白表達的影響

表6 過表達FHIT對細(xì)胞DU145增殖、凋亡的影響

表7 過表達FHIT對細(xì)胞DU145增殖、凋亡蛋白表達的影響

2.5 抑制FHIT能逆轉(zhuǎn)抑制miR-320e對細(xì)胞DU145增殖、凋亡的影響 與anti-miR-NC組比較，anti-miR-320e明顯影響細(xì)胞DU145中FHIT、Cyclin D1、P21、Bax、Bcl-2蛋白表達量、細(xì)胞活性和細(xì)胞凋亡率(P<0.05)。與anti-miR-320e+si-NC組比較，anti-miR-320e與si-FHIT共轉(zhuǎn)染明顯減少FHIT、P21、Bax蛋白表達量,而提高Cyclin D1、Bcl-2蛋白水平，提高24 h、48 h、72 h的細(xì)胞活性，并且減少細(xì)胞凋亡率，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見圖4，表8、9。

圖4 抑制FHIT能逆轉(zhuǎn)抑制miR-320e對細(xì)胞DU145增殖、凋亡蛋白表達的影響

表8 抑制FHIT能逆轉(zhuǎn)抑制miR-320e表達對細(xì)胞DU145增殖、凋亡的影響

表9 抑制FHIT能逆轉(zhuǎn)抑制miR-320e表達對細(xì)胞DU145增殖、凋亡蛋白表達的影響

3 討論

miRNA是一類高度保守和內(nèi)源性的基因表達調(diào)節(jié)因子，它們是長度通常為18～22個核苷酸的單鏈非編碼RNA分子[9]。miRNA與特定mRNA的3，UTR中的靶位點發(fā)生互補性結(jié)合，使mRNA降解或翻譯抑制。miRNA參與許多重要的細(xì)胞過程，包括增殖，細(xì)胞周期，細(xì)胞凋亡，粘附和轉(zhuǎn)移，其中大多數(shù)構(gòu)成癌癥的關(guān)鍵標(biāo)志[10]。近年來，miRNA已被發(fā)現(xiàn)在不同類型的人類癌癥中異常表達，通過充當(dāng)癌基因或抑癌基因參與腫瘤進展，包括前列腺癌[11-13]。miR-320e屬于miR-320家族，總共包含37個序列，miR-320e位于PRKD2基因內(nèi)含子-3內(nèi)的染色體19 q13.32處[14]。與miR-320家族的其他成員相比，miR-320e在人類癌癥中的功能作用知之甚少。研究表明，miR-320e在脊索瘤中異常表達，可作為肺癌發(fā)展的早期預(yù)測因子[15,16]。Perez-Carbonell等[14]學(xué)者首次報道了miR-320e在結(jié)直腸癌(colorectal cancer，CRC)患者中的臨床表達水平和預(yù)后相關(guān)性，發(fā)現(xiàn)miR-320e經(jīng)常在CRC患者中表達上調(diào)，尤其是在晚期腫瘤中，并且miR-320e與腫瘤大小呈正相關(guān)趨勢(P=0.1047)并伴有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，證實高水平的miR-320e與CRC患者預(yù)后不良相關(guān)。本研究中，miR-320e在前列腺癌細(xì)胞DU145內(nèi)的表達明顯上調(diào)(P<0.05)，與前人[6,7]研究結(jié)果一致。考察miR-320e失調(diào)時的細(xì)胞功能，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，抑制miR-320e表達顯著降低DU145細(xì)胞活性、Cyclin D1、Bcl-2蛋白表達，而提高細(xì)胞凋亡率、P21、Bax蛋白水平(P<0.05)，下調(diào)miR-320e表現(xiàn)出對前列腺癌的抑制作用。

為了闡明miR-320e的作用機制，miRNA基因靶標(biāo)的鑒定對于理解miR-320e在前列腺癌中的作用至關(guān)重要。本實驗利用生物信息學(xué)工具TargetScan篩選出miR-320e的預(yù)測靶標(biāo)FHIT。FHIT是一種小的細(xì)胞質(zhì)蛋白，在體外切割三磷酸腺苷(Ap3A)以產(chǎn)生ADP和AMP，并且Ap3A在FHIT缺陷細(xì)胞中逐漸積累[17]。FHIT在超過一半的人類癌癥中缺失，F(xiàn)HIT的損失可能會改變?nèi)藧盒阅[瘤多種生物學(xué)功能，包括凋亡減少，上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)增加，提高了耐基因毒性劑，改變活性氧的產(chǎn)生和基因組不穩(wěn)定性，當(dāng)恢復(fù)其表達時，可以誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡并抑制致瘤性[18-20]。既往研究表明，F(xiàn)HIT參與多種人類惡性腫瘤的腫瘤發(fā)生，包括肺癌，乳腺癌，胰腺癌，腎癌等，起著腫瘤抑制作用[21,22]。FHIT在前列腺癌中的表達明顯低于癌旁正常組織，F(xiàn)HIT表達與前列腺癌的發(fā)生發(fā)展有一定的聯(lián)系[23,24]。Xu等[25]研究了FHIT基因?qū)侨饬黾?xì)胞增殖和凋亡的調(diào)控作用，發(fā)現(xiàn)骨肉瘤細(xì)胞系Saos2中FHIT mRNA和蛋白表達明顯下調(diào)，過表達FHIT明顯抑制細(xì)胞增殖，而增加細(xì)胞凋亡率，這與本實驗的結(jié)果一致，即FHIT基因抑制前列腺癌細(xì)胞增殖并促進其凋亡，說明FHIT扮演著抑癌因子的角色參與前列腺癌的發(fā)生發(fā)展。另外，本項研究運用雙熒光素酶報告實驗證實miR-320e可以靶向調(diào)控FHIT的表達，抑制FHIT表達可以逆轉(zhuǎn)抑制miR-320e表達對前列腺癌細(xì)胞增殖和凋亡的影響。這些結(jié)果表明，靶向FHIT表達可能是miR-320e調(diào)節(jié)前列腺癌細(xì)胞增殖、凋亡的重要途徑。

總之，本研究觀察到miR-320e在前列腺癌細(xì)胞中表達上調(diào)，抑制miR-320e表達會抑制前列腺癌細(xì)胞增殖并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，而miR-320e通過直接靶向調(diào)控FHIT的表達在前列腺癌細(xì)胞增殖和凋亡中發(fā)揮重要作用，證明了miR-320e對前列腺癌發(fā)生和進展的影響。因此，miR-320e可能成為前列腺癌患者的新型治療靶點。