不同沙棘品種種子中α-亞麻酸含量差異及相關基因分析

張 彤，呂中睿，魏繼華，張國昀，羅紅梅，何彩云＊

(1. 中國林業科學研究院林業研究所，國家林業和草原局林木培育重點實驗室，北京 100091；2. 中國林業科學研究院沙漠林業實驗中心，內蒙古 磴口 015200)

沙棘(Hippophae rhamnoidesL.)是胡頹子科沙棘屬的一種雌雄異株的灌木或小喬木，耐旱性和耐寒性良好。沙棘果實具有獨特的藥用和營養價值，在中國和俄羅斯有上百年的藥用歷史[1]。沙棘果實富含維生素、有機酸、氨基酸、脂肪酸、抗氧化劑和類黃酮[2-4]，在炎癥性疾病、肝臟性疾病、動脈粥樣硬化等疾病的治療以及保護心臟等方面具有顯著功效[5]。在沙棘種子含有的眾多脂肪酸中，α-亞麻酸（α-Linolenic acid，C18:3N3）的含量十分豐富，且α-亞麻酸對大腦發育、心血管健康、炎癥治療等都具有重要作用[6-9]，但α-亞麻酸是人體必需脂肪酸，不能在人體內合成，只能通過食物攝取。豆油、花生油等常見植物食用油中的主要脂肪酸為油酸、亞油酸、棕櫚酸和硬脂酸[10-11]，α-亞麻酸含量極低，而沙棘中高積累20.3%～36.3%的α-亞麻酸[12]，并且沙棘作為耐旱木本植物可以在沙地、荒山、鹽堿地等邊際土地生長，可避免與大田油料作物爭奪土地，是理想的α-亞麻酸供給對象。

目前，油料作物脂肪酸合成途徑及調控基因的研究較多，在沙棘的相關研究中多圍繞脂肪酸組分及脂肪酸測定方法展開，少有針對沙棘中α-亞麻酸合成機制的研究。本研究選取α-亞麻酸含量存在差異的2個沙棘品種種子，對其含量差異及相關基因進行分析，在基因表達水平上研究沙棘中α-亞麻酸合成及代謝規律，為培育高α-亞麻酸含量的沙棘良種奠定理論基礎。

1 實驗材料

沙棘種子采自中國林業科學研究院沙漠林業實驗中心（內蒙古磴口縣），2個沙棘品種——蒙古大果沙棘向陽（Hippophae rhamnoides‘Mongolia’）（XY）和中國沙棘豐寧（H. rhamnoides‘Sinensis’）（FN）的種子分別采自3個不同的發育時期，依次為未成熟期（T1）、半成熟期(T2)和成熟期(T3)，在這3個時期沙棘種子的種皮顏色依次呈現為白色、黑白相間斑點色、黑色。因沙棘種皮與果皮的轉色期基本一致，為保證時期界定更加精準，同時利用色差計測量沙棘果皮的紅綠色指標 a 值和黃藍指標 b 值，計算色澤比（h=a/b），種皮呈白色且果皮h值介于-0.18～-0.10的界定為T1時期，種皮呈黑白相間斑點色且果皮h值介于0.20～0.28的界定為T2時期，種皮呈黑色且果皮h值介于0.52～0.60的界定為T3時期。沙棘果實采集后快速將種子從果實中剝離，放入液氮中進行速凍，然后轉移至-80℃冰箱長久保存，用于下一步分析。

2 實驗方法

2.1 脂肪酸提取

將樣品冰上解凍，取50 mg樣品于2 mL離心管中。加入1 mL的氯仿甲醇(2:1 v/v)溶液，超聲30 min。取上清液，加入1%硫酸甲醇溶液2 mL，80℃水浴，甲酯化30 min，隨后加入1 mL的正己烷萃取，5 mL的純水洗滌。吸取上清液500 μL，加入25 μL的水楊酸甲酯（500 mg·L-1）作為內標，混勻加入進樣瓶，進樣量1 μL，分流比 10∶1，分流進樣，進行GC-MS 檢測。

2.2 色譜-質譜分析

樣品采用 AgilentDB-WAX 毛細管柱(30 m×0.25 mmID×0.25 μm)氣相色譜系統進行分離。程序升溫：初始溫度為 50℃，保持 3 min，隨后以10℃·min-1的速度升溫至220℃并維持 20 min。載氣為氦氣，載氣流速1.0 mL·min-1。樣本隊列中每間隔6個實驗樣本設置1個QC樣本，用于檢測和評價系統的穩定性及重復性。采用 Agilent7890A/5975C 氣-質聯用儀進行質譜分析。進樣口溫度280℃，離子源溫度230℃，傳輸線溫度250℃。電子轟擊電離（EI）源，SIM 掃描方式，電子能量70 eV。采用 MSDChemStation 軟件提取色譜峰面積及保留時間。繪制標準曲線，計算樣品中中長鏈脂肪酸的含量。

2.3 轉錄組測序分析

按照Qingen（Qingen，DE）試劑盒[13]操作說明對樣品中的總RNA進行提取，并去除總RNA中DNA片段的殘留。分別使用NanoPhotometer分光光度儀、Qbuit 2.0 熒光計和Qubit RNA 檢測試劑盒以及Agilent 2100和RNA Nano 6000試劑盒檢測RNA純度、RNA濃度以及RNA完整性。RNA檢測合格后進行文庫制備。使用Illumina HiSeq 2000 對RNA文庫進行測序，獲得原始測序數據。為了保證測序數據質量，對原始數據進行過濾，從而獲得高質量數據（Clean data），用于后續生物信息分析。首先使用DESeq R（1.18.0）[14]進行基因表達量分析，篩選差異表達基因，然后通過GOseq R數據包[15]和KOBAS（2.0）[16]分別對差異表達基因進行GO功能注釋和KEGG通路分析。

3 結果與分析

3.1 兩個沙棘品種種子中脂肪酸組分差異分析

利用氣相色譜分析，在2個品種沙棘的種子中共檢測到27種脂肪酸（表1），其中，主要脂肪酸為C18:3N3(α-亞麻酸)、C18:2(亞油酸)、C16:0(棕櫚酸)、C18:1(油酸)、C18:0(硬脂酸)。隨著果實不斷成熟，2個品種沙棘種子中，5種主要脂肪酸的含量均逐漸增加，其中，α-亞麻酸和亞油酸含量上升幅度較大。

從圖1可以看出：XY與FN的5種主要脂肪酸的含量均在T2時期表現出顯著差異。按照脂肪酸含量從大到小排序，在XY中，依次為α-亞麻酸、亞油酸、油酸、棕櫚酸、硬脂酸，含量最高的脂肪酸為α-亞麻酸，亞油酸次之；而在FN中，脂肪酸從大到小排序依次為亞油酸、α-亞麻酸、棕櫚酸、油酸、硬脂酸，亞油酸大于α-亞麻酸含量（圖1）。

在T2時期，2個沙棘品種種子中α-亞麻酸與亞油酸的比值（α-亞麻酸/亞油酸）存在顯著差異（P＜0.05）。XY中，T2時期3個樣本的α-亞麻酸/亞油酸比值分別為1.21、1.17、1.16，而FN分別為0.92、0.75、0.92（表2）。

3.2 轉錄組數據分析探究沙棘種子α-亞麻酸的合成規律

以XY與FN種子的3個發育時期、每個發育時期3個生物學重復的18個樣品為材料，通過RNAseq測序分析共產生140 G clean data，933 483 428條高質量序列(Clean reads)(Q20＞97%;Q30＞93%)，其中，81.5%的序列唯一比對到參考基因組上。對2個品種3個不同發育時期及相同時期不同品種間的表達基因進行差異分析，共鑒定出24 917個差異表達基因（DEGs）。從圖2A樣本DEGs的主成分分析(PCA)可以看出：2個沙棘品種各個時期生物學重復聚類效果良好，不同時期之間與不同品種之間數據離散效果良好。通過DEGs的分布圖(圖2B)可以看出：在T1-T3的發育過程中，在T2時期XY與FN之間的DEGs最多。

表1 XY與FN 2個沙棘品種種子在不同發育時期脂肪酸含量的動態變化Table 1 Dynamic changes of fatty acid composition in the seeds of XY and FN at different developmental stages μg·g-1

依據序列同源性將24 917個差異表達基因進行GO功能注釋，2 605個基因注釋為生物過程（Biological process），554個基因注釋為細胞組成（Cellular component），1 354個基因注釋為分子功能（Molecular function）。為了進一步了解基因的生物學功能和相互作用，使用KEGG數據庫對基因進行通路富集分析。24 917個DEGs注釋到122個KEGG通路，其中，有94個DEGs的功能富集于脂肪酸合成（Fatty acid biosynthesis）通路、脂肪酸代謝（Fatty acid metabolism）通路、α-亞麻酸代謝（α-Linolenicacid metabolism）通路和亞油酸代謝（Linoleicacid metabolism）通路。

圖1 沙棘XY與FN種子中主要脂肪酸組分的含量變化Fig. 1 Distribution of main fatty acid components in XY and FN seeds of sea buckthorn

表2 T2時期XY與FN種子中的C18:3N3/C18:2Table 2 C18:3n3 / C18:2 in XY and FN seeds of sea buckthorn at T2

圖2 主成分分析與差異表達基因上調和下調分布情況Fig. 2 PCA and up-regulated and down-regulated distribution of DEGs

圖3 沙棘種子發育過程中與α-亞麻酸合成相關的基因表達模式Fig. 3 Gene expression profiles of Alpha linolenic acid biosynthetic genes during seed development of sea buckthorn

3.3 α-亞麻酸合成與代謝相關基因表達分析

T2時期，基因FAD2在2個沙棘品種中的表達量差異顯著（圖3），在XY中的表達量顯著高于FN，是FN的3.83倍，為α-亞麻酸（C18:3N3）的合成提供充足底物。FAD2基因在XY和FN中表達量均為先上升后下降，在第2時期表達量急劇上升達到峰值，與XY和FN中的亞油酸（C18:2）含量在第二時期顯著增加（圖1）相一致。

基因FAD3和基因FAD7調控亞麻酸生成α-亞麻酸（圖4），在FN中的整體表達水平遠低于XY，與XY中α-亞麻酸含量高于FN（圖1）的結果相一致。基因FAD3在FN種子中的表達呈下調趨勢，在XY種子中的表達水平先急劇上升，在T2時期達到峰值，后在T3時期表達量下調；T1時期，基因FAD3在XY中的表達量是FN 中的2.02倍，T2時期基因FAD3在XY和FN中的表達差異顯著，在XY中的表達量是FN中的13.63倍（圖3）。基因FAD7在XY和FN中的表達趨勢均為先上升后下降，T1和T2時期在XY中的表達量顯著高于在FN中的表達量，T1時期在XY中的表達量是FN 中的2.09倍，T2時期在XY中的表達量是FN 中的1.72倍（圖3）。

基因LOX調控α-亞麻酸氧化（圖4），生成脂肪酸氫過氧化物，是調控α-亞麻酸轉化為其他物質的第一步，基因LOX3.1在XY和FN種子的生長發育過程中表達趨勢均為逐漸下降，在FN中的表達量高于XY，T1時期基因LOX3.1在FN中的表達量是XY中的3.58倍，T2時期基因LOX3.1在FN中的表達量是XY中的8.02倍（圖3）。基因LOX3.2在FN中的表達量同樣高于XY，T1時期在FN中的表達量是XY中的3.24倍，T2時期在FN中的表達量是XY中的7.12倍（圖3）。基因LOX的高表達不利于α-亞麻酸的積累，與圖1中所顯示的XY中α-亞麻酸含量高于FN的結果相一致。

4 討論

沙棘種子中富含不飽和脂肪酸，其中，α-亞麻酸含量一般較高。α-亞麻酸作為人體必需脂肪酸，具有多種有益的生理功能，因此，為了進一步提高沙棘種子中α-亞麻酸含量，培育沙棘新品種和良種，在分子水平上研究沙棘中α-亞麻酸的合成代謝規律至關重要。亞油酸是α-亞麻酸合成的底物，脫飽和生成亞麻酸[17-18]。本研究選取的2個沙棘品種中，α-亞麻酸/亞麻酸的比值存在顯著差異，XY種子中α-亞麻酸是含量最高的脂肪酸，亞油酸含量次之，而在FN中正相反，含量最高的脂肪酸是亞油酸，α-亞麻酸含量次之。因此，基于這2個品種存在的差異挖掘沙棘種子中調控亞油酸向α-亞麻酸轉化的關鍵基因以及抑制α-亞麻酸分解的關鍵基因，探究α-亞麻酸合成代謝規律。

FAD2催化油酸轉化為亞油酸[19-21]，FAD2基因表達量下降使亞油酸合成受阻，進而影響α-亞麻酸的生成，而FAD2基因的高表達可以為α-亞麻酸的合成提供充足的底物。2個沙棘品種種子中的亞油酸含量在T2時期快速積累，與T2時期基因FAD2的表達水平急劇上升相一致。在XY和FN種子中，T1和T2時期之間的亞油酸含量差異顯著。T3時期基因FAD2的表達量降低，亞油酸含量積累速度明顯下降。

α-亞麻酸在FAD3和FAD7的催化下由亞油酸脫飽和產生[17-18]。FAD3與FAD7同屬于ω-6 型脂肪酸去飽和酶，已有的研究表明，基因FAD3在植物種子α-亞麻酸的合成過程中起到關鍵作用[22-24]。實驗表明，擬南芥的FAD3基因在大豆中異位表達可使大豆中α-亞麻酸含量增加，大豆的FAD3C基因在芝麻中特異性表達同樣也可使芝麻中α-亞麻酸的含量顯著提高[25]。此外，Wu等將麻風樹的JcFAD3基因在擬南芥的種子中特異性表達使擬南芥種子中α-亞麻酸的含量提高了20.50%～24.94%；同時亞油酸的含量相比野生型降低了11.4%～23.5%[26]。在煙草中過表達擬南芥FAD7基因，同樣使煙草中α-亞麻酸的含量升高且亞油酸含量下降[23]。

在T1和T2時期，XY中基因FAD3和基因FAD7的表達量遠高于FN，尤其在T2時期，基因FAD3在XY和FN中的表達差異顯著，在XY中的表達量是FN中的13.63倍，調控大量亞油酸脫飽和生成α-亞麻酸，因此，XY種子中α-亞麻酸的含量大于亞油酸的含量，而FN中亞油酸含量比α-亞麻酸高。這解釋了為何基因FAD2在XY種子中的表達量高于FN，但亞油酸含量卻是FN種子大于XY種子。

基因LOX是α-亞麻酸代謝過程中的關鍵基因，是調控α-亞麻酸轉化為其他物質的第一步，調控α-亞麻酸氧化，生成脂肪酸氫過氧化物[27-29]。基因LOX3.1和基因LOX3.2在XY和FN發育的T1時期表達量處于3個時期的最大值，抑制α-亞麻酸的積累，協同基因FAD2、FAD3、FAD7在T1時期的低表達水平，導致T1時期α-亞麻酸含量處于低水平，T2時期基因LOX3.1和LOX3.2表達量下調，基因FAD2、FAD3、FAD7表達量急劇上升，因而α-亞麻酸含量在T2時期顯著增長。同時，基因LOX3.1和LOX3.2在FN種子中的表達量高于XY種子，抑制FN種子中α-亞麻酸的積累，使FN種子中α-亞麻酸積累量低于XY。

沙棘種子中α-亞麻酸的高積累源于多個基因的協同調控作用，基因FAD2、FAD3、FAD7的高表達協同基因LOX3.1和LOX3.2的低表達使α-亞麻酸的高積累得以實現。

本研究在基因和代謝水平上研究沙棘中α-亞麻酸合成代謝規律，對進一步提高沙棘種子中α-亞麻酸含量、培育沙棘良種具有重要意義。

圖4 與α-亞麻酸生物合成與代謝相關的途徑Fig. 4 Pathway related to the biosynthesis and metabolism of α-linolenic acid

5 結論

通過對2個不同沙棘品種種子中中長鏈脂肪酸和轉錄組數據聯合分析得出：沙棘種子中α-亞麻酸的高積累源于多個基因的協同調控作用。基因FAD2調控油酸去飽和生成亞油酸，其高表達為α-亞麻酸的合成提供了充足的底物。α-亞麻酸在基因FAD3和基因FAD7的調控下由亞油酸去飽和產生，基因FAD3和基因FAD7的高表達促進亞油酸向α-亞麻酸轉化，使α-亞麻酸積累，同時使亞油酸含量下降。沙棘種子中基因LOX3.1和LOX3.2是α-亞麻酸代謝過程中的關鍵基因，其表達水平下降有利于種子中α-亞麻酸的積累。