刺槐幼苗對NaCl脅迫的生理生化響應

甘紅豪，趙 帥，楊澤坤，褚建民

(國家林業和草原局濱海林業研究中心，中國林業科學研究院林業研究所，國家林業和草原局林木培育重點實驗室，林木遺傳育種國家重點實驗室，北京 100091)

土壤中過量的鹽分會抑制植物光合作用、誘導產生氧化脅迫、滲透脅迫及離子脅迫等，阻礙植物的正常生長發育進程[1-2]。植物通過合成積累游離脯氨酸、氨基酸和可溶性蛋白質等滲透調節物質，并誘導增強植物體內抗氧化酶如過氧化氫酶（CAT）、抗壞血酸過氧化物酶（APX）和谷胱甘肽還原酶（GR）等的活性，從而增強了植物的耐鹽能力[3-4]。

水分是植物在鹽脅迫下維持正常生長的重要條件。液泡膜內在蛋白（TIPs）和質膜內在蛋白（PIPs）作為植物水通道蛋白（AQPs）家族的重要成員[5]，通過調節植物水分運輸，影響植物逆境應答，促進鹽脅迫下植物生長發育[4]。鹽脅迫下，轉TsTIP1;1及TsPIP1;1基因水稻（Oryza sativaL.）的光合能力顯著增強、細胞持水能力明顯提高[5]；過表達PIP2;1增強了擬南芥（Arabidopsisthaliana(L.) Heynh.）細胞的持水能力[6]。位于液泡膜上的Na+/H+逆向轉運蛋白NHX1參與調控植物液泡滲透勢，可以把細胞質內過量的Na+隔離到液泡內，減輕了擬南芥受到的鹽脅迫，從而減弱了鹽脅迫對其生長的抑制[7]。

刺槐（Robinia pseudoacaciaL.）生長迅速、適應性強，具有耐干旱、耐瘠薄、繁殖快等特點，是鹽堿地區造林的先鋒樹種，具有良好的經濟和環境效益[8-9]。近年從逆境生理、品種選育等方面對刺槐的耐鹽機理進行了一定研究，然而，鹽脅迫下各生理指標對刺槐耐鹽能力的影響及刺槐體內相關基因轉錄表達情況的研究較少。本研究以1年生刺槐幼苗為試驗材料，綜合分析NaCl脅迫對刺槐幼苗生長、生理、離子含量及相關基因表達的影響，初步解析刺槐耐鹽機制，從而為建立刺槐抗逆性生態生理指標體系提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料及處理方法

以1年生刺槐播種苗為試驗材料，在中國林業科學研究院科研溫室中進行盆栽（花盆規格：盆高×盆口直徑=22 cm×20 cm）培養，基質為V珍珠巖∶V蛭石=3∶1。培養條件為：自然光照；晝夜溫度：25/20°C；相對濕度：50%～60%。試驗開始前，每株幼苗每2 d澆灌1/2 Hoagland 營養液（pH值5.5）100 mL，待苗高約20 cm時，選取生長一致且健壯的幼苗進行試驗。

試驗分3個處理組，每個處理組10株幼苗，處理濃度分別為0、50、100 mmol·L-1NaCl溶液。NaCl處理期間，為保證NaCl濃度的一致性，每3 d用含同等濃度NaCl溶液的1/2 Hoagland營養液淋洗花盆基質，處理27 d后，每個處理組選取6株長勢基本一致的幼苗進行收獲。

1.2 測定方法

1.2.1 光合參數測定及材料收獲 收獲前，每個處理組隨機選取3株幼苗，每株選取3片成熟的葉片，在晴天上午 9: 00—11: 00 用 Li 6 400光合作用測量系統 ( LI-Cor, Lincoln, Nebraska, USA) 測定刺槐幼苗葉片的光合作用參數；同時，計算刺槐葉片水分利用效率(WUE) = 凈光合速率（A）/蒸騰速率（E）[10]和氣孔限制值(Ls) = 1-Ci/Ca(Ci為胞間CO2濃度；Ca為空氣中CO2濃度，本試驗中該值為400 μmol·mol-1)[11]。

光合測定結束后，收獲植株。收獲時，根、莖、葉分別收獲并記錄各部分的生物量。所有材料保存在液氮中，并在液氮中使用球磨儀（NM400，Retsch, Haan, Germany）將其研成粉末，于-80°C保存備用。稱取各處理組刺槐根、莖和葉片鮮樣60 mg，于65°C烘干，計算樣品干濕比及干質量。

1.2.2 葉片相對含水量和葉綠素含量測定 采用烘干稱重法測定各處理組刺槐幼苗葉片相對含水量（RWC）。參照Wellburn[12]提出的方法測定刺槐幼苗葉片中葉綠素含量。

1.2.3 丙二醛（MDA）含量測定 根據 Hodges等[13]提出的方法測定刺槐樣品中丙二醛（MDA）的含量。

1.2.4 游離脯氨酸、氨基酸、可溶性蛋白質含量測定 根據Tamás等[14]的方法測定樣品游離脯氨酸含量。使用氨基酸（AA）含量檢測試劑盒（索萊寶，北京）測定樣品中氨基酸含量。樣品中可溶性蛋白含量參照Luo等[15]的方法測定。

1.2.5 酶活性測定 參照Polle等[16]的方法測定CAT和APX的活性；參照 Gamble等[17]的方法測定GR的活性。

1.2.6 離子含量分析 將烘干的根和葉片樣品研磨粉碎后，過0.5 mm篩，稱取0.2～0.3 g樣品（精確至0.001 g），置于消煮管中，加入8 mL濃硝酸，搖勻后過夜，并做空白對照。消解前加入2 mL H2O2，靜置20 min，隨后使用Mars高壓微波消解儀（Mars-6，CEM Corp.，USA）消解，之后加熱趕酸，待消解液剩余約 2 mL 時停止加熱，冷卻后過濾到50 mL容量瓶中并定容、搖勻。靜置 20 min，吸取上清液 10 mL 至離心管中，使用等離子體發射光譜儀 iCAP 6 300（Thermo Scientific，USA）測定Na+、K+、Ca2+、Mg2+含量，并計算Na+/K+、Na+/Ca2+、Na+/Mg2+比值。

1.2.7 水通道蛋白及Na+/ H+逆向轉運蛋白基因表達分析 使用植物RNA提取試劑盒（DP432，天根）提取刺槐根和葉樣品中總RNA，并進行濃度及純度檢測。使用PrimeScript? RT reagent Kit with gDNA Eraser（RR047B，TaKaRa）將純化后的RNA進行反轉錄，獲得cDNA，然后使用熒光定 量PCR儀（ABI7500，Applied Biosystems，USA）進行相對熒光定量（qPCR）分析。引物由北京Invitrogen公司合成，具體信息見表1，內參基因為Actin[18]。

表1 qRT-PCR 引物信息Table 1 Primers used for qRT-PCR

1.3 數據統計分析

采用2-ΔΔCT法獲得qPCR的差異表達倍數。對本試驗獲得的所有數據使用Statgraphics Centurion XVI.I （STN, St, Louis, MO, USA）軟件進行分析。數據分析之前，對其進行正態分布檢驗。所有數據采用單因素進行分析，以NaCl作為自變量因素。采用LSD法進行數據間差異顯著性分析，當F檢驗的P-Value ＜ 0.05時，認為數據間的差異顯著。

2 結果與分析

2.1 NaCl處理對刺槐幼苗生長和光合能力的影響

在NaCl處理下，刺槐幼苗根、莖和葉的干質量均出現不同程度的下降，根冠比增加（表2），說明NaCl處理影響了刺槐的正常生長發育。隨NaCl濃度的升高，刺槐幼苗葉片相對含水量顯著降低，與0 mmol·L-1NaCl處理組相比，50、100 mmol·L-1NaCl處理組刺槐幼苗葉片的相對含水量分別減少了7.0%和18.2%。

NaCl處理使刺槐幼苗葉中葉綠素a（Chl a）、葉綠素b（Chl b）和類胡蘿卜素（Car）均呈下降趨勢（表3）。與0 mmol·L-1NaCl處理組相比，100 mmol·L-1NaCl 處 理 使 刺 槐 幼 苗 葉 片Chl a、Chl b和Car含量分別降低了29.8%、30.5%和36.6%。刺槐凈光合速率（A）、氣孔導度（Gs）、胞間CO2濃度（Ci）和蒸騰速率（E）均隨著NaCl濃度增加顯著減少，而水分利用效率（WUE）和氣孔限制值（Ls）出現不同程度的增加（表4）。100 mmol·L-1NaCl 處理 組刺 槐 的A、Gs、Ci和E僅為0 mmol·L-1NaCl處理組刺槐的42.3%、40.0%、84.7%和31.1%。50 mmol·L-1NaCl 處理對刺槐幼苗葉片的WUE和Ls無顯著影響；而100 mmol·L-1NaCl 處理組刺槐幼苗葉片的WUE和Ls分別比0 mmol·L-1NaCl 處理組刺槐升高了39.3%和25.0%。

表2 NaCl對刺槐幼苗生物量、根冠比及葉片相對含水量的影響Table 2 The effects of NaCl concentrations on biomass, root to shoot ratio and leaf relative water content of R. pseudoacacia

表3 NaCl對刺槐幼苗光合色素含量及光合作用參數的影響

Table 3 The effects of NaCl concentrations on photosynthetic pigment content ofR. pseudoacacia

NaCl濃度/（mmol·L-1)葉綠素a Chl a/（mg g-1）葉綠素b Chl b/（mg·g-1）類胡蘿卜素Car/（mg·g-1）葉綠素a+b Chl a+b/（mg g-1）0 9.26 ± 0.80 a 2.69 ± 0.21 a 2.02 ± 0.18 a 11.95 ± 1.02 a 50 7.92 ± 0.05 ab 2.27 ± 0.10 ab 1.48 ± 0.04 b 10.19 ± 0.15 ab 100 6.50 ± 0.05 b 1.87 ± 0.05 b 1.28 ± 0.05 b 8.38 ± 0.11 b P-Value * * ** *

表4 NaCl對刺槐幼苗光合作用參數、水分利用效率及氣孔限制的影響Table 4 The effects of NaCl concentrations on photosynthetic parameters, WUE and Ls of R. pseudoacacia

2.2 NaCl處理對刺槐幼苗丙二醛（MDA）含量的影響

表5表明：在50 mmol·L-1NaCl處理下，刺槐根和葉中MDA含量均是0 mmol·L-1NaCl處理組的1.2倍；與0 mmol·L-1NaCl處理相比，100 mmol·L-1NaCl處理組刺槐幼苗根和葉中MDA含量雖然出現一定程度增加，但差異不顯著。

2.3 NaCl處理對刺槐幼苗CAT、APX和GR活性的影響

表5表明：隨NaCl濃度的增加，CAT、APX和GR的活性變化不同；在根中，與0 mmol·L-1NaCl 處理組刺槐相比，50 mmol·L-1NaCl處理對CAT和GR活性無顯著影響，但使APX活性顯著升高；100 mmol·L-1NaCl處理使CAT、APX和GR活性顯著升高。在葉中，50 mmol·L-1NaCl處理使CAT活性顯著升高，但對APX和GR活性無顯著影響；100 mmol·L-1NaCl處理組刺槐CAT、APX和GR活性分別是0 mmol·L-1NaCl 處理組的3.0、1.8、1.7倍。

表5 NaCl對刺槐幼苗根和葉丙二醛含量，過氧化氫酶、抗壞血酸過氧化物酶和谷胱甘肽還原酶活性的影響Table 5 The effects of NaCl on MDA content, CAT, APX and GR activities in roots and leaves of R. pseudoacacia

2.4 NaCl處理對刺槐幼苗游離脯氨酸、氨基酸及可溶性蛋白質的影響

NaCl處理導致刺槐幼苗根和葉中游離脯氨酸、氨基酸和可溶性蛋白質出現不同程度升高（表6）。在根中，與0 mmol·L-1NaCl 處理組相比，50 mmol·L-1NaCl處理使刺槐幼苗游離脯氨酸、氨基酸和可溶性蛋白質分別升高了72.1%、86.4%和63.2%；100 mmol·L-1NaCl處理使刺槐幼苗游離脯氨酸升高了74.4%，可溶性蛋白質升高了156.7%，但對氨基酸含量影響不顯著。在葉中，與0 mmol·L-1NaCl 處理組相比，50 mmol·L-1NaCl處理使刺槐幼苗游離脯氨酸和可溶性蛋白質分別升高了136.4%和64.3%；100 mmol·L-1NaCl處理使刺槐幼苗游離脯氨酸升高了381.8%，氨基酸升高了21.3%。

表6 NaCl對刺槐幼苗根和葉中游離脯氨酸、氨基酸及可溶性蛋白質含量的影響Table 6 The effects of NaCl on free proline, amino acid and soluble protein contents in roots and leaves of R. pseudoacacia

2.5 NaCl處理對刺槐幼苗Na+、K+、Mg2+ 和Ca2+含量及離子含量比值的影響

表7表明：隨NaCl濃度的增加，刺槐幼苗根和葉中Na+含量顯著升高，50 mmol·L-1NaCl處理組刺槐根和葉中Na+是0 mmol·L-1NaCl處理組的2.5和3.1倍，100 mmol·L-1NaCl處理組刺槐根和葉中Na+是0 mmol·L-1NaCl處理組的4.6和5.6倍，且根中Na+含量高于葉中含量。50、100 mmol·L-1NaCl處理使刺槐幼苗根中K+含量比0 mmol·L-1NaCl處理組分別降低了16.3% 和11.1%，但對葉中K+含量影響不顯著。NaCl處理使刺槐幼苗根中Mg2+含量逐漸升高，而葉中Mg2+含量逐漸降低，與0 mmol·L-1NaCl 處理組相比，100 mmol·L-1NaCl 處理使根中Mg2+含量升高了29.7%，使葉中Mg2+含量下降了28.2%。NaCl處理對刺槐幼苗根和葉中Ca2+含量影響不顯著。

表7 NaCl對刺槐幼苗根和葉中離子含量的影響Table 7 The effects of NaCl on ion contents in roots and leaves of R. pseudoacacia

NaCl處理下，刺槐幼苗根和葉中Na+/K+、Na+/Mg2+和Na+/Ca2+顯著升高，且NaCl濃度越高，比值越大（表8）。50 mmol·L-1NaCl處理使根中Na+/K+、Na+/Mg2+和Na+/Ca2+分別升高了200.0%、110.3%和150.0%，使葉中Na+/K+、Na+/Mg2+和Na+/Ca2+分別升高了100.0%、200.0%和100.0%。與0 mmol·L-1NaCl處理組刺槐相比，100 mmol·L-1NaCl處理組刺槐根中Na+/K+、Na+/Mg2+和Na+/Ca2+分別升高了4.2、2.5和3.9倍，葉中Na+/K+、Na+/Mg2+和Na+/Ca2+分別升高了3.0、6.0和3.0倍。

表8 NaCl對刺槐幼苗根和葉中Na+/K+、Na+/Mg2+ 和Na+/Ca2+ 的影響Table 8 The effects of NaCl on Na+/K+, Na+/Mg2+ and Na+/Ca2+ in roots and leaves of R. pseudoacacia

2.6 NaCl處理對刺槐幼苗水通道蛋白及Na+ / H +逆向轉運蛋白基因表達的影響

對刺槐幼苗根和葉中編碼水通道蛋白（TIP1;1，PIP1;1和PIP2;1）及Na+/H+逆向轉運蛋白（NHX1）的mRNA 的表達水平進行分析，結果（表9）表明：在刺槐幼苗根中，50和100 mmol·L-1NaCl處理使TIP1;1、PIP1;1、PIP2;1和NHX1基因的mRNA 表達水平顯著升高，分別是0 mmol·L-1NaCl處理組的6.4、11.1、28.6、6.4倍和5.6、6.1、14.6、3.2倍；在葉中，與0 mmol·L-1NaCl處理組刺槐幼苗相比，50 mmol·L-1NaCl處理對TIP1;1、PIP1;1和NHX1基因的mRNA 表達水平影響不顯著，100 mmol·L-1NaCl處理使TIP1;1、PIP1;1和NHX1基因的mRNA表達水平增加了3.7、1.6和1.3倍，但NaCl處理使PIP2;1基因的mRNA 表達水平顯著降低。

表9 NaCl處理對刺槐幼苗根和葉中相關基因表達分析Table 9 The expression of aquaporin and Na+ / H + reverse transporter genes in roots and leaves of R. pseudoacacia under NaCl treatments.

3 討論

鹽脅迫是限制植物生長發育的主要非生物逆境之一[2]。本研究中，NaCl處理顯著抑制了刺槐幼苗的生長發育，致使刺槐幼苗根、莖和葉的干質量減少，根冠比增加，表明刺槐幼苗在受到NaCl脅迫后，會通過抑制地上部分生長、擴大根冠比，從而增強根系對土壤中水和營養元素的吸收，以此來適應逆境條件[19-20]。相對含水量作為衡量植株水分狀況的指標之一，常用來指示植物的逆境脅迫程度。本研究發現，NaCl處理使刺槐葉片相對含水量下降，這可能與鹽脅迫降低了植物根系向地上部分運輸水分的能力有關[21]。

葉綠素是植物進行光合作用的主要色素，其含量對植物的耐鹽能力具有重要影響[22]。本研究中，在NaCl處理下，刺槐幼苗葉片的Chl a、Chl b、Chl a+b及Car含量均出現不同程度降低。這是由于過量的NaCl破壞了植物的葉綠體結構、提高了相關葉綠素酶的活性，導致葉綠體色素合成受阻或者分解加快[22]。刺槐幼苗葉片凈光合速率（A）在受到NaCl脅迫后下降，光合能力減弱。一般認為，NaCl脅迫影響植物光合作用的因素主要分為氣孔因素和非氣孔因素，前者表現為Gs和Ci同時下降、Ls升高，后者主要表現為A降低而Ci升高[11]。本研究中，隨NaCl濃度增加，刺槐幼苗葉片A、Gs、Ci和E均顯著減少，Ls升高，說明NaCl脅迫對刺槐幼苗光合能力的限制主要由氣孔因素導致。水分利用效率（WUE）反映了植物對環境適應能力的強弱，NaCl處理使刺槐葉片的WUE升高，說明在一定濃度范圍內，NaCl脅迫能夠提高刺槐的WUE，這可能是由于NaCl脅迫誘導刺槐幼苗葉片Gs和E降低減少了蒸騰耗水引起的[23]。

研究表明，在一定鹽濃度范圍內，白榆（Ulmus pumilaL.）[24]、中國檉柳（Tamarix chinensisLour.）[25]等體內抗氧化酶活性均隨著鹽濃度的升高而增大。本研究同樣發現，NaCl脅迫誘導刺槐幼苗根和葉中CAT、APX和GR活性增強，從而加快清除植株體內過量的活性氧。在NaCl脅迫下，刺槐幼苗通過合成并積累游離脯氨酸、氨基酸和可溶性蛋白質，從而調節滲透勢、維持細胞含水量，提高刺槐抗氧化能力，增強了對NaCl脅迫的適應能力，這與在茶樹（Camellia sinensisL.）[26]中得到的結果相似。NaCl處理導致刺槐幼苗根和葉中丙二醛（MDA）含量升高，并且100 mmol·L-1NaCl處理組刺槐MDA含量低于50 mmol·L-1NaCl處理組，這可能是在較高濃度NaCl脅迫下，刺槐體內抗氧化系統活性較高，能夠較快的清除活性氧物質，減輕了其對刺槐細胞膜系統的損傷。

本研究中，NaCl 處理使刺槐幼苗根和葉中Na+積累量顯著升高，且Na+在刺槐幼苗根中的積累量遠大于在葉中的積累量。在多數植物中，Na+的主要毒性部位是葉片[2]，因此，植物根系對Na+的留存能力可以減輕Na+對地上部分的傷害；同時，植物也可以利用根中積累的Na+進行滲透調節，降低植物水勢[19]。隨著NaCl濃度升高，刺槐幼苗根中K+含量顯著減少，Na+/K+顯著增加，這可能是由于在鹽脅迫下，根系對Na+的吸收會與對K+的吸收產生競爭，導致根中K+含量顯著減少所致[3,27]；然而，NaCl對刺槐幼苗葉中K+含量無顯著影響，但Na+/K+卻顯著升高，這可能是由于地上部分在NaCl脅迫下生長減弱，引起K+在刺槐根和葉中重新分配所致[27]。Mg2+作為組成植物葉綠素分子的元素之一，本研究發現，NaCl脅迫導致刺槐幼苗根中Mg2+含量上升，葉中Mg2+含量降低，同時根和葉中Na+/Mg2+顯著升高，刺槐通過在根中積累Mg2+，提高了滲透調節能力，維持了刺槐幼苗根中質子跨膜運輸濃度梯度[28]。研究發現，在較低濃度NaCl 脅迫下，脹果甘草（Glycyrrhiza inflataBatal.）[28]及酸棗（Ziziphus jujubavar.spinosa(Bunge) Hu ex H. F. Chow）[29]的根系通過積累Ca2+提高細胞滲透調節能力，緩解Na+毒害。本研究中，50和100 mmol·L-1NaCl處理對刺槐幼苗根和葉中Ca2+含量無顯著影響，從而維持NaCl脅迫下刺槐體內細胞膜結構的穩定、調控細胞生長及胞內酶的活性。

在植物適應鹽脅迫的過程中，植物水通道蛋白（AQPs）通過調控植物細胞滲透壓及蒸騰作用，調控植物逆境應答，促進植物生長發育[5]。研究發現，NaCl 處理導致水稻根中OsTIP1;1、TsPIP1;1及TsTIP1;1表達水平顯著上調[30-31]。本研究中，NaCl處理后，刺槐幼苗根中水通道蛋白基因TIP1;1、PIP1;1及PIP2;1轉錄被誘導。TIP1;1作為定位在液泡膜上的水通道蛋白，參與植物細胞滲透調節；而PIP1;1和PIP2;1均定位在質膜上，前者主要用于調節植物滲透勢，后者主要負責跨膜水分運輸。因此，刺槐通過誘導上述3種基因的合成表達，并與滲透調節物質共同作用，調節細胞的滲透勢，增強了刺槐根系的吸水及持水能力，增強了刺槐的耐鹽能力。在葉中，TIP1;1和PIP1;1轉錄水平在低濃度NaCl處理下變化不顯著，但在較高濃度NaCl處理下顯著升高，這可能是由于在較高濃度NaCl下，葉片通過誘導它們的轉錄表達，增強葉片細胞的滲透調節能力，并抑制PIP2;1的轉錄表達，減弱了葉片失水速率，減緩了鹽脅迫引起的凈光合速率的下降速度，從而增強了刺槐的耐鹽能力[6]。然而，在玉米中，NaCl脅迫抑制了PIPs和TIPs的表達[32]，這可能是與AQPs基因在逆境條件下表達存在組織、器官以及時間上的特異性有關[33]。NHX1是定位于液泡膜上的Na+/H+逆向轉運蛋白，參與調控植物液泡滲透勢[3]。本研究中，NaCl處理后，刺槐幼苗根和葉中NHX1的表達水平顯著升高。刺槐通過增強NHX1基因的轉錄表達，將根和葉中過量的Na+從細胞質轉運到液泡中，減緩了細胞質的受損程度，重建細胞中的離子平衡，并且將Na+轉化為滲透調節物質，增強了自身的耐鹽能力[34]。

4 結論

NaCl脅迫抑制了刺槐幼苗的生長以及光合作用能力，同時誘導刺槐體內產生氧化脅迫和離子失衡。為應對NaCl脅迫造成的不利影響，刺槐通過增強葉片水分利用效率、合成并積累抗氧化酶（CAT、APX和GR）和滲透調節物質（游離脯氨酸、氨基酸和可溶性蛋白質）并誘導相關基因（TIP1;1、PIP1;1、PIP2;1及NHX1）的轉錄表達，增強了自身的鹽脅迫適應能力。然而，植物對鹽脅迫的適應機制非常復雜，還需進一步深入研究。