杉木人工林土壤溶磷細菌篩選及培養條件優化

韋宜慧，陳嘉琪，董玉紅，厚凌宇，焦如珍

(中國林業科學研究院林業研究所，林木遺傳育種國家重點實驗室，北京 100091)

磷是植物生長和發育的重要營養元素之一，參與植物的重要代謝途徑，如光合作用，養分吸收及細胞分裂[1-2]。然而土壤中的磷大部分是難以利用的難溶性磷酸鹽，可被植物直接吸收利用的水溶態磷含量低，土壤磷利用率通常只有10%～15%，少部分植物利用率達到25%[3-4]。因此，磷常常成為限制植物生產力的主要因素之一。杉木是我國南方特有的速生用材樹種，木材產量超過了全國商品用材的四分之一[5]。然而南方地區淋溶強烈，土壤富含鋁離子和鐵離子，磷極易被固定，土壤磷利用率極低，嚴重制約了杉木人工林可持續發展[6]。因此，越來越多的研究已經轉向土壤磷可持續利用。眾多研究發現，土壤中存在大量具有溶磷能力的微生物，這些微生物通過自身代謝作用，將土壤中的難溶性磷酸鹽轉化為植物可吸收利用的水溶性磷[7-9]。開發利用溶磷微生物，提高土壤磷利用率，已經成為當前研究熱點。目前大多數報道的溶磷微生物菌分離自農作物，Mukhtar[10]等從甘蔗根際分離出2株高效溶磷細菌，均屬芽孢桿菌屬（Bacillus），Zhao等[11]從玉米根際篩選到1株耐鹽的洋蔥伯克氏菌（Burkholderia cepacia）。

紅壤是我國杉木種植區主要土壤類型之一，具有“酸”、“粘”、“瘦”的特點，土壤磷素有效性低，嚴重制約著杉木生產力的提高[12]。本研究從紅壤地區杉木人工林土壤分離篩選溶磷細菌，通過生理生化和16SrDNA基因序列確定其分類地位，運用單因素試驗和正交試驗優化培養條件，為杉木菌肥的開發利用提供高效溶磷菌株。

1 材料與方法

1.1 菌株的分離與篩選

土壤樣品采自江西省大崗山山下林場（27°36′ N，114°24′ E）18年生杉木人工林，該區域屬于低山丘陵地貌，海拔220～300 m，土壤類型為紅壤。通過S形采樣法在樣地內布設7個采樣點，用土鉆鉆取0～20 cm土壤，將7個采樣點土壤混合裝入滅菌袋后立即帶回實驗室，4℃保存。稱取10 g新鮮土樣，置于裝有90 mL無菌水的三角瓶中，振蕩30 min。將土壤懸浮液連續稀釋10倍至10-4，取0.05 mL稀釋度為10-3、10-4土壤懸浮液涂布于Pikovskaya(PVK)[13]瓊脂平板上，28℃培養5～7 d，檢查平板是否存在產生透明暈圈的菌落。挑取溶磷圈明顯的菌落，用連續劃線法進一步純化。

采用鉬銻抗比色法[14]對菌株溶磷能力進行測定：在250 mL三角瓶中加入100 mL PVK液體培養基（磷酸鈣滅菌后加入），接入1 mL培養過夜的菌液，置于恒溫搖床中28℃，180 r·min-1培養7 d后測定菌株溶磷能力。

1.2 形態觀察及菌株鑒定

根據伯杰細菌鑒定手冊，研究菌株的生理生化特性。采用試劑盒法提取細菌基因組DNA，PCR擴增后進行16SrDNA測序。擴增引物為：27F：5′AG AGTTTGATCCTGGCTCAG3′；1492R：5′TACGG CTACCTTGTTACGACTT3′，擴增體系參考劉彩霞的方法[15]。測序結果在GenBank中進行比對，運用MEGA7構建系統發育樹確定菌株分類地位。

1.3 菌株培養條件優化

1.3.1 單因素試驗 根據溶磷能力測定的結果，選擇溶磷能力強的菌株進行溶磷培養條件優化。為了驗證菌株的溶磷能力，所有培養過程均采用PVK培養基。影響菌株溶磷能力的因素主要有培養時間、培養初始pH、培養溫度、接種量、碳源、氮源、磷源。通過單因素試驗，培養時間設置為24、48、72、96、120、144、168 h；培養基pH設置為4、5、6、7、8、9、10；培養溫度設置為10、15、20、25、30、35、40℃；接種量設置為0.5、1、1.5、2、2.5、3、3.5、4%。分別以1%(w/v)、0.05%(w/v)、0.5%(w/v)的濃度提供不同碳源（葡萄糖、蔗糖、乳糖、麥芽糖、甘露醇、可溶性淀粉）、氮源（硫酸銨、硝酸鉀、氯化銨、尿素、蛋白胨、酵母浸粉）、磷源（磷酸鈣、磷酸鐵、磷酸鋁）。接種后置于恒溫搖床中28℃，180 r·min-1培養7 d，測定培養基中菌株生長量、有效磷含量，以未接種PVK液體培養基為對照。菌株生長量通過測定培養液在波長600 nm時的光密度值表示（OD600）。有效磷含量采用鉬銻抗比色法測定。

1.3.2 正交試驗 根據單因素試驗的結果，設計了蔗糖（2.0%，2.5%，3.0%），氯化銨（0.1%，0.15%，0.2%），pH（5，5.5，6），溫度（25℃，30℃，35℃）四因素三水平的正交試驗對溶磷條件進行優化。選用L9(34)正交表，因素水平見表1。

表1 L9(34)正交試驗因素水平Table 1 Factors and levels employed in orthogonal test

1.4 數據分析

數據分析采用SPSS20.0軟件進行方差分析（ANOVA）。

2 結果與分析

2.1 溶磷能力測定

利用PVK平板分離杉木人工林土壤中的溶磷細菌，經過多次純化得到13株具有明顯溶磷圈的細菌。各菌株溶磷能力如表2所示，培養液中有效磷含量在21.61～195.61 mg·L-1之間，有效磷含量最高的是P5(195.61 mg·L-1)。因此，選擇P5作為后續研究供試菌株。

2.2 菌株生理生化鑒定及16SrDNA序列分析

革蘭氏染色試驗表明菌株P5為革蘭氏陰性菌，在PVK瓊脂平板上28℃培養3 d后的菌落形態為圓形，邊緣整齊，白色不透明且表面光滑濕潤，具有明顯溶磷圈。以下生理生化試驗為陽性：硝酸鹽還原試驗，葡萄糖試驗，阿拉伯糖試驗，甘露醇試驗以及檸檬酸鹽試驗。以下生理生化試驗為陰性：甲基紅試驗，氧化酶/VP試驗，硫化氫試驗，明膠水解試驗及丙二酸鹽試驗。

將菌株P5 16SrDNA序列與Genbank中的模式菌株序列進行比較，P5菌株與Burkholderia ubonensis序列相似度為99.09%，一致性為98.8%。選擇數據庫中相似度最高的7株標準菌株及1株外群菌株構建系統發育樹，如圖1所示。P5菌株與Burkholderia ubonensis同源，相似度和一致性均大于98%，置信度為78，結合生理生化判斷P5為Burkholderia ubonensis。

表2 菌株溶磷能力Table 2 Phosphorus solubilizing ability of bacterial strains

圖1 P5菌株系統發育樹狀圖Fig. 1 Phylogenetic tree of P5

2.3 培養條件優化

2.3.1 菌株在不同碳源、氮源、磷源培養基中生長情況 由圖2可看出菌株生長量與有效磷含量對不同培養時間、pH、溫度及接種量的響應有顯著差異，但兩者之間無明顯相關性。培養時間對菌株溶磷量的影響如圖2a所示，培養基中菌株生長量隨著時間的增加先升高后降低，在72 h達到最大值，有效磷含量則在96 h達到最高后趨于平穩。從圖2b可以看出pH在4～10范圍內，有效磷含量和菌株生長量均呈現先上升后逐漸下降的規律，P5生長適應范圍為5～6，最適pH為5。菌株生長量和有效磷含量在酸性條件下顯著高于堿性條件，表明P5耐低pH。溫度在10～40℃范圍內，P5培養液中有效磷含量也呈現先上升后下降的趨勢（圖2c）。溫度在25～30℃之間，菌株生長量和有效磷含量均達到最大值。在40℃時菌株光密度值OD600大于1，顯著高于10～15℃，說明菌株較耐高溫。菌株生長量和有效磷含量都隨著接種量的增加先升高后降低（圖2d）。菌株生長量在接種量為3%時達到了最高點，而有效磷含量在接種量為2%時達到最大值。單因素試驗結果表明，菌株P5最適培養時間為72～96 h，最適pH為5～6，最適溫度在25 ～30℃之間，最適接種量為1.5%。

6種不同碳源（葡萄糖、蔗糖、乳糖、麥芽糖、甘露醇、淀粉）對菌株溶磷能力的影響差異顯著（圖3a），葡萄糖、蔗糖作為唯一碳源時，有效磷含量和菌株生長量顯著高于其余4種碳源。其中蔗糖是菌株P5的最佳碳源，其次為葡萄糖＞麥芽糖＞乳糖＞甘露醇＞淀粉。為了確定蔗糖濃度對菌株解磷能力的影響，在0.5%～4%（w/v）范圍內設置8個濃度蔗糖（梯度為0.5%）。圖3b表明隨著蔗糖濃度的增加，有效磷含量逐漸增加，蔗糖濃度為3%時有效磷含量最高，濃度繼續增加時有效磷含量無明顯變化。菌株生長量隨蔗糖濃度的增加先上升后下降，在濃度為1%～2%間達到最大值。不同蔗糖濃度下P5菌株生長量及溶磷量無明顯相關性。

將不同氮源（硫酸銨、硝酸鉀、氯化銨、尿素、蛋白胨、酵母浸粉）以0.05%（w/v）的濃度加入培養基中，測定不同氮源對有效磷含量的影響。如圖4a所示，在以硫酸銨和氯化銨為氮源時，菌株P5有效磷含量顯著高于其余4種氮源，其中氯化銨培養基中菌株生長量最高，是菌株P5溶解磷的最佳氮源。將氯化銨按0.05%～0.4%（w/v）范圍內分8個濃度（梯度為0.05%）添加到培養基中，結果如圖4b，濃度為0.15%時培養基中有效磷含量最高，高于或低于該濃度的培養基有效磷含量均減少。氯化銨濃度對菌株生長的影響與有效磷含量變化一致，氯化銨濃度為0.2%、0.15%時菌株生長量和有效磷含量分別達到最高值。

由圖5a可知，3種不同磷源條件下，有效磷含量及菌株生長量大小排序為磷酸鈣＞磷酸鋁＞磷酸鐵。在0.5%～4%（w/v）范圍內分8個濃度（梯度為0.5%）將磷酸鈣添加到培養基中，結果如圖5b所示，菌株P5在0.5%～4%（w/v）范圍內有效磷含量呈現先上升后下降的趨勢，在1.5%濃度時有效磷含量達到最高。菌株生長量在濃度范圍為0.5%～1.5%之間無明顯變化，濃度增加至2%時菌株生長量顯著減少。

圖2 培養條件對P5溶磷能力的影響Fig. 2 Effect of culture conditions on the ability of P5 to dissolve phosphorus

圖3 不同碳源及不同蔗糖濃度對P5溶磷能力的影響Fig. 3 Phosphorus dissolving ability of P5 under different different carbon sources and sucrose concentrations

2.3.2 正交設計優化 在單因素試驗的基礎上，選擇蔗糖、氯化銨、pH、溫度進行四因素三水平正交試驗。從表3和表4可知，因素B、C對菌株解磷能力影響顯著（P＜0.05），因素D極顯著（P＜0.01），因素A不顯著，影響P5溶磷能力的因素主次順序為D＞B＞C＞A，即溫度＞氯化銨＞pH＞蔗糖。由表3可知，因素A、B、C、D優水平為A2、B3、C2、D2，優組合為A2B3C2D2。由于因素A的水平改變對試驗結果幾乎無影響，從經濟角度考慮，選A1，因此培養條件優組合為A1B3C2D2，即蔗糖濃度為2.0%，氯化銨濃度為0.2%，pH為5.5，溫度為30℃。為了驗證該條件下P5溶磷能力，進行了補充試驗，試驗結果表明該條件下P5培養液中有效磷含量高達268.69 mg·L-1，顯著高于優化前培養條件（PVK液體培養基），后者有效磷含量為195.61 mg·L-1。證明通過正交試驗，調整后的培養條件更有利于提高菌株P5的溶磷能力。

圖4 不同氮源及不同氯化銨濃度對P5溶磷能力的影響Fig. 4 Phosphorus dissolving ability of P5 under different different nitrogen sources and ammonium chloride concentrations

圖5 不同磷源及不同磷酸鈣濃度對P5解磷能力的影響Fig. 5 Phosphorus dissolving ability of P5 under different different phosphorus sources and calcium phosphate concentrations

3 討論

從杉木人工林土壤中篩選到一株高效溶磷菌株P5，通過生理生化試驗和16SrDNA基因序列分析鑒定為Burkholderia ubonensis。研究表明，隨著培養時間的增加，菌株生長量先上升后下降，而有效磷含量上升到最高后保持平穩，可能是因為菌株生長達到了穩定期，菌體繁殖速度開始下降，但菌株分泌的代謝產物在這段時間內大量積累，促進了難溶性磷的溶解[16-17]。菌株P5生長最適pH范圍為5～6，最適溫度范圍為25～30℃。楊艷紅等[18]研究得出，芽孢桿菌的最適生長溫度和pH分別為37℃、7.0；劉曉璐等[19]從煙草根際分離的功能菌最適生長溫度為30℃，pH為7.5。研究表明，pH和溫度通過影響微生物體內酶驅動過程而改變代謝速率，低溫條件下菌株生長繁殖緩慢，活力下降，高溫則容易導致菌體自溶[20]。接種量逐漸增加，菌株對空間和營養物質的爭奪越強烈，導致細菌代謝速度逐漸減慢，代謝產物的累積速率減緩，從而導致有效磷含量減少，也可能是因為菌株生長過程產生了有毒代謝物質或細胞的自溶作用減緩了細菌代謝速率[21-22]。土壤pH值對林木生長有重要影響，極酸、極堿立地不利于林木生長，改良需要花費大量人力物力，且微生物肥料使用受限，土壤質量難以提高[23]。本研究篩選的P5菌株在4～10時均可生長，可在不同pH值土壤中應用。

表3 L9(34)正交試驗結果Table 3 Results of the orthogonal test

表4 正交試驗方差分析Table 4 Variance analysis of the orthogonal test

本研究篩選的P5菌株的最佳碳源和氮源分別是蔗糖和氯化銨，而喬志偉等[24]分離的具有溶磷能力的伯克氏菌W4的適宜碳源、氮源分別為葡萄糖和硝酸鉀。Park等[25]發現伯克氏菌Burkholderia vietnamiensi的最佳碳源和氮源分別是葡萄糖和尿素。其原因可能與微生物代謝機制的多樣性以及不同碳、氮源的物理化學性質有關，不同碳源和氮源通過改變微生物代謝路徑，導致其分泌的有機酸的種類和數量發生變化，從而改變了溶磷微生物的溶磷能力[26-29]。不同濃度碳源、氮源對不同菌株生長和溶磷效果影響不同，劉玉鳳[28]等分離的假單胞菌的最適葡萄糖濃度為1%；Park等[25]研究發現葡萄糖濃度為3.5%時Burkholderia vietnamiensi的生長量最大，有效磷含量最高。本研究中蔗糖濃度為3%時，菌株生長量和有效磷達到最大值，此時菌株分泌大量有機酸，抑制了微生物的生長代謝，導致菌株生長量開始下降，培養液有效磷含量增加受限；氮源濃度高則引起微生物對磷的吸收增加，從而降低有效磷含量[30]。不同磷源對溶磷微生物的溶磷能力與難溶性磷酸鹽的結構有關，本研究中菌株P5對磷酸鈣的溶解效果最佳。菌株溶磷機制包括以下幾種：分泌有機酸，呼吸酸化，NH4+同化，胞外酶水解[31-33]。Ca-P較易溶解可能與溶磷微生物分泌的有機酸種類有關，也可能是Ca-P的溶解是微生物分泌質子和有機酸螯合陽離子雙重作用的結果，而Al-P和Fe-P只能通過螯合作用來釋放磷酸鹽[34-35]。磷源濃度也是影響溶磷微生物溶磷量的因素之一，磷濃度高，使微生物釋放的磷再次被陽離子固定，形成難溶性磷酸鹽，而低磷供應減少微生物蛋白質合成，降低微生物活性[36]。培養條件優化結果顯示pH值對菌株溶磷量的影響極顯著，溫度、氮源對菌株溶磷量影響顯著，這主要是因為菌株在不同培養條件下，基因調控及蛋白合成均會發生變化，從而引起菌株細胞膜通透性及對營養物質的吸收、菌株代謝產物及胞外酶活的變化[37-38]。然而，需要進一步研究以了解P5的溶磷機制，并在溫室或田間條件下探索其促生能力及促生機制。

4 結論

從杉木人工林土壤分離到1株耐酸，耐高溫的高效溶磷細菌Burkholderia ubonensisP5。單因素試驗表明P5最適培養時間為72～96 h，最適pH為5.0～7.0，最適溫度在25℃～30℃之間，最適接種量為1.5%，最適碳源為蔗糖，氮源為氯化銨，磷源為碳酸鈣。正交試驗表明P5在蔗糖濃度為2.0%，氯化銨濃度為0.2%，pH為5.5，溫度為30℃條件下溶磷能力顯著提高。對菌株溶磷條件進行優化是有效發揮細菌溶磷能力的必要前提，為菌株P5的溶磷機制及其對植物生長的作用等后續研究奠定了基礎。