金花茶組植物花朵內多酚組分含量分析

姜麗娜，李紀元＊，范正琪＊，童 冉，莫潤宏，李志輝，蔣昌杰

(1. 中國林業科學研究院亞熱帶林業研究所，浙江 杭州 311400；2. 南寧市金花茶公園，廣西 南寧 530022)

植物多酚為植物體內具有多元酚結構的次生代謝物，是一種天然有機抗氧化劑，可清除自由基，具有較高的營養和保健價值，目前廣泛應用于抗氧化、抗衰老、提高人體免疫力等方面，同時還具有一定的醫療作用，能預防心血管病、抗炎、抗癌等[1-3]。前人對綠茶[4]、紅茶[5]、黑茶[6]、花茶[7]等茶葉中的多酚含量、組分、功能等有較詳細的研究。

金花茶組（Sect.ChrysanthaH. T. Chang）植物屬山茶科（Theaceae）山茶屬（CamelliaL.），為常綠灌木或小喬木，分布于廣西、貴州、云南及越南中部和北部。金花茶組植物與茶樹（C. sinensis(L.) O. Ktze.）為同科同屬植物[8]，其各器官中均含有大量的多酚、黃酮組分[9-10]。金花茶組植物發現較晚，相關研究較少，僅有少量對其葉片多酚[11-12]及花朵類黃酮的研究[13-14]，關于其花朵多酚組分與含量的研究尚未見報道。

葉創興等[15]、梁盛業[16]、張宏達等[8]、閔天祿[17]及Wu等[18]先后從表觀形態學角度研究了金花茶組植物的系統分類。分子標記技術也應用到金花茶組植物親緣關系的研究中[19-21]；但目前仍有新的金花茶物種被發現或引進[22]，關于金花茶的分類仍存在諸多分歧，因此，需要更多的佐證來解析其分類系統。利用化學標記進行植物分類的研究較多，Li等[23]利用25種黃酮組分作為化學標記研究了山茶屬紅山茶組（Sect.Camellia(L.) Dyer in Hook.）植物的演化關系，Fan等[24]基于芳香類成分對山茶屬連蕊茶組（Sect.TheopsisCoh. St.）22個物種進行了分類研究；Li等基于多酚組分研究了茶樹的品種分類與起源[25]及茶樹雜交后代與父母本間的親緣關系[26]。花作為金花茶重要的生殖、分類器官，其多酚組分與含量及其與植物分類的相關性具有重要的研究價值。

本研究利用高效液相色譜（HPLC）方法，對金花茶組植物花朵不同器官的主要多酚組分含量進行測定分析，揭示金花茶組植物花朵中的多酚組成及其物種間的差異，進而利用多酚組分含量對金花茶組植物進行分類，探析多酚組分在金花茶植物分類中應用的可行性。

1 材料與方法

1.1 試材及取樣

2018年1、3、9、11月份，分別在廣西南寧市金花茶公園（108°20′53″ E，22°49′11″ N，海拔75 m）國家級金花茶種質資源庫內，采集金花茶組22個物種全開期的花朵，快速將各花器官分離，分類包裝，液氮速凍后，干冰運回實驗室，-80℃保存備用。

采樣物種：中東金花茶（C. achrysanthaChang et S. Y. Liang）、薄葉金花茶（C. chrysanthoidesChang）、崇左金花茶（C. chuangtsoensisS. Y.Liang et L. D. Huang）、顯脈金花茶（C. euphlebiaMerr. Ex Sealy）、箱田金花茶（C. hakodaeNinh）、凹脈金花茶（C. impressinervisChang et S. Y.Liang）、檸檬黃金花茶（C. limoniaC. F. Liang et Su）、隴瑞金花茶（C. longruiensisS. Y. Liang et X. J. Dong）、龍州金花茶（C. lungzhouensisLuo）、小花金花茶（C. micranthaS. Y. Liang et Y. C.Zhong）、小果金花茶（C. microcarpaChang）、多瓣金花茶（C. multipetalaS. Y. Liang et C. Z.Deng）、金花茶（C. nitidissimaChi）、小瓣金花茶（C. parvipetalaJ. Y. Liang et Su）、潘氏金花茶（C. phaniiHakoda et Ninh）、平果金花茶（C.pinggaoensisFang）、毛籽金花茶（C. ptilospermaS. Y. Lang et Q. D. Chen）、毛瓣金花茶（C.pubipetalaY. Wan et S. Z. Huang）、頂生金花茶（C. terminalisS. Y. Liang）、天峨金花茶（C.tianeensisS. Y. Liang et Y. T. Luo）、東興金花茶（C. tunghinensisChang）、武鳴金花茶（C.wumingemsisS. Y. Liang et C. R. Fu）。試驗共采集金花茶組植物22個花瓣樣品、20個雄蕊樣品、14個萼片樣品。

標準樣品：沒食子酸（GA）、沒食子兒茶素（GC）、表沒食子兒茶素（EGC）、兒茶素（C）、表兒茶素（EC）、表沒食子兒茶素沒食子酸酯（EGCG）、沒食子兒茶素沒食子酸酯（GCG）、表兒茶素沒食子酸酯（ECG）和兒茶素沒食子酸酯（CG）9種標準樣品均購自上海源葉生物科技有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 樣品提取 稱取樣品0.6 g，液氮快速研磨后，倒入25 mL試管中，加入提取液（甲醇:水:甲酸:三氟乙酸=70:27:2:1）5 mL，用石臘膜封口。浸提24 h，中間搖動幾次，浸提均勻。提取完成后，用脫脂棉過濾，去掉殘渣。用有機微孔過濾膜（0.22 μm）過濾后，將濾液裝入進樣瓶中，進行上機分析，提取液可暫時避光存放于-20℃冰箱。

1.2.2 樣品檢測 采用美國安捷倫1260系列高效液相色譜儀（Agilent Technologies 1260 Infinty），色譜柱為Waters SunFire C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）。洗脫流動相為：A相：2%的甲酸水溶液；B相：純乙腈。洗脫程序：0.0～9.0 min，98%降至90.7%的B相；9.0～15.0 min，90.7%的B相；15.0～20.5 min，90.7%降 至85%的B相；20.5～29.5 min，85%降至75%的B相；29.5～30.0 min，75%升至98%的B相；30.0～34.0 min，98%的B相。流速為1.0 mL·min-1，進樣量為10 μL，柱溫為30℃，檢測波長278 nm。

1.3 數據分析

應用 Microsoft Office Excel 2007 進行數據統計及作圖，使用 SPSS- Statistics 19.0 進行單因素方差分析、聚類分析等。

2 結果與分析

2.1 花瓣內多酚組分及含量分析

金花茶組22個物種花瓣樣品9種多酚組分的HPLC色譜圖（圖1）顯示：在本實驗檢測環境下，所測9種組分全部可以有效分離，沒食子酸（GA）、沒食子兒茶素（GC）、表沒食子兒茶素（EGC）、兒茶素（C）、表兒茶素（EC）、表沒食子兒茶素沒食子酸酯（EGCG）、沒食子兒茶素沒食子酸酯（GCG）、表兒茶素沒食子酸酯（ECG）、兒茶素沒食子酸酯（CG）可依次鑒定出。9種組分在線性范圍內線性良好，相關系數均大于0.999 00（表1）。

圖1 9種多酚組分HPLC色譜圖Fig. 1 HPLC chromatogram of 9 polyphenol standard samples

花瓣樣品的9種組分中（表2），GCG、ECG、CG在每個物種均檢測到，EC只在箱田金花茶的花瓣中未檢測到，EGC、C分別有8個和9個物種未檢測到，EGCG有10個物種未檢測到，GA僅在6個物種中檢測到，GC僅在崇左金花茶中檢測到。花瓣中多酚平均含量分別為：EC（0.814 mg·g-1）＞ EGC（0.155 mg·g-1）＞GCG（0.142 mg·g-1）＞CG（0.122 mg·g-1）＞ECG（0.112 mg·g-1）＞C（0.087 mg·g-1）＞EGCG（0.023 mg·g-1）＞GA（0.012 mg·g-1）＞GC（0.007 mg·g-1）。多酚總量中，凹脈金花茶花瓣含量最高為3.069 mg·g-1，平果金花茶與東興金花茶含量相近且最低，分別為0.546、0.535 mg·g-1。

表1 9種多酚組分的回歸方程、相關系數Table 1 Regression equation, correlation coefficient of 9 polyphenol standard samples

所測22個物種中，19個物種的花瓣中EC含量為9種多酚組分中含量最高的，其中，18個物種的花瓣中EC含量占多酚總量的比例超過50%（圖2），僅檸檬黃金花茶花瓣中的ECG含量最高，武鳴金花茶花瓣中的C含量最高，箱田金花茶花瓣中的GCG含量最高。

2.2 雄蕊內多酚組分及含量分析

所測20個物種雄蕊樣品的9種組分中（表2），EGC、EC、GCG、ECG、CG 5種組分在每個物種的雄蕊中均檢測到，C在4個物種的雄蕊中未檢測到，EGCG在3個物種的雄蕊中未檢測到；GA僅在7個物種的雄蕊中檢測到，GC僅在小果金花茶、薄葉金花茶和小花金花茶3個物種的雄蕊中檢測到。雄蕊中多酚平均含量分別為：EC（1.250 mg·g-1）＞ EGC（0.470 mg·g-1）＞GCG（0.191 mg·g-1）＞ECG（0.168 mg·g-1）＞C（0.096 mg·g-1）＞CG（0.075 mg·g-1）＞GC（0.054 mg·g-1）＞GA（0.035 mg·g-1）＞EGCG（0.030 mg·g-1）。多酚總量中，多瓣金花茶雄蕊中最高為6.932 mg·g-1，檸檬黃金花茶雄蕊中含量最低為0.644 mg·g-1。

所測20個物種中，18個物種的雄蕊中EC含量為9種多酚組分中含量最高的，其中，14個物種的雄蕊中EC含量占多酚總量的比例超過50%（圖2），僅平果金花茶的雄蕊中CG含量最高，武鳴金花茶的雄蕊中C含量最高。

2.3 萼片內多酚組分及含量分析

所測14個物種萼片樣品中，多酚組分種類較多，其中，GA在其中8個物種的萼片中檢測到，GC可在11個物種的萼片中檢測到（表2）；C在3個物種的萼片中未檢測到，EGCG在平果金花茶的萼片中未檢測到，剩余的5種組分在所測14個物種的萼片中均檢測到。萼片中多酚平均含量分別為：EC（1.370 mg·g-1）＞EGC（0.501 mg·g-1）＞ECG（ 0.236 mg·g-1）＞C（0.230 mg·g-1）＞GCG（0.211 mg·g-1）＞EGCG（0.074 mg·g-1）＞CG（0.041 mg·g-1）＞GC（0.037 mg·g-1）＞GA（0.029 mg·g-1）。多酚總量中，凹脈金花茶萼片中含量最高5.377 mg·g-1，東興金花茶萼片中含量最低為0.763 mg·g-1。

表2 金花茶組植物花朵中多酚組分及含量Table 2 Contents of polyphenols in flowers of yellow Camellia mg·g-1

所測的14個物種中，12個物種的萼片中EC含量為9種多酚組分中含量最高，其中，11個物種萼片中的EC含量占多酚總量的比例超過50%（圖2），僅有東興金花茶萼片中ECG含量最高，武鳴金花茶萼片中C含量最高。

3類器官中，花瓣中的CG含量最高，雄蕊中次之，萼片中最低；雄蕊中GA、GC含量最高，萼片中次之，花瓣中最低；萼片中EGC、C、EC、EGCG、GCG、ECG 6種組分及多酚總量均最高，雄蕊中次之，花瓣中最低。總體而言，萼片中的多酚組分含量高于雄蕊和花瓣（圖3）。

2.4 花朵各器官多酚組分含量聚類分析

采用Ward法，分別依據花瓣、雄蕊、萼片3類器官的多酚組分含量，對金花茶組植物進行了聚類分析。22個花瓣樣品的多酚組分含量聚類為2大類，4小類：小果金花茶、小花金花茶、金花茶、小瓣金花茶、天峨金花茶、薄葉金花茶、龍州金花茶、東興金花茶、檸檬黃金花茶、平果金花茶、顯脈金花茶11個物種為Ⅰ-A，崇左金花茶、箱田金花茶為Ⅰ-B；隴瑞金花茶、中東金花茶、毛瓣金花茶、頂生金花茶、毛籽金花茶、多瓣金花茶、潘氏金花茶、凹脈金花茶8個物種為Ⅱ-A，武鳴金花茶單獨為Ⅱ-B（圖4）。

圖2 金花茶組植物3類器官中EC含量占多酚總量比例Fig. 2 EC/total in 3 kinds of organs in yellow Camellia

圖3 金花茶組植物3類器官中多酚組分含量Fig. 3 Contents of polyphenols in 3 kinds of organs from yellow Camellia

圖4 金花茶組22個物種的花瓣樣品聚類Fig. 4 The dendrogram of 22 petal samples in yellow Camellia

20個雄蕊樣品的多酚組分含量聚類為3大類，4小類：檸檬黃金花茶、平果金花茶、東興金花茶、龍州金花茶、小瓣金花茶、薄葉金花茶、顯脈金花茶、武鳴金花茶8個物種為Ⅰ-A；頂生金花茶、中東金花茶、凹脈金花茶、隴瑞金花茶、崇左金花茶、箱田金花茶、毛籽金花茶、天峨金花茶、金花茶9個物種為Ⅰ-B；小果金花茶、小花金花茶2個物種為Ⅱ；多瓣金花茶單獨為Ⅲ（圖5）。

圖5 金花茶組20個物種的雄蕊樣品聚類Fig. 5 The dendrogram of 20 stamen samples in yellow Camellia

圖6 金花茶組14個物種的萼片樣品聚類Fig. 6 The dendrogram of 14 sepal samples in yellow Camellia

14個萼片樣品的多酚組分含量聚類為2大類，3小類：顯脈金花茶、小果金花茶、金花茶、檸檬黃金花茶、天峨金花茶、頂生金花茶、崇左金花茶、東興金花茶、毛籽金花茶、平果金花茶10個物種為Ⅰ-A；武鳴金花茶為Ⅰ-B；凹脈金花茶、隴瑞金花茶、毛瓣金花茶3個物種為Ⅱ（圖6）。

將以上3類器官的多酚組分聚類分析結果與金花茶形態分類系統結果進行比較（表3）發現：雄蕊多酚分類結果與分類系統中重復的物種數量較多，均在10個以上，二者分類相同的物種數量也較高（8個以上），與各形態學分類系統的相似率高達80.00%至90.00%，故此結果可以作為分類系統一個很好的補充。花瓣多酚分類結果與分類系統中重復的物種數量也較多（10個以上），但二者分類相同的物種數量較低，相似率僅58.33%至81.82%。萼片多酚分類結果與分類系統中重復的物種數量較低（僅8～11個），雖然與部分分類系統相似率較高（相似率75.00%至88.89%），但其對分類系統的補充作用不穩定，說服力不強。

表3 多酚組分分類結果與形態分類系統比較Table 3 Comparison of classification results of polyphenols with morphological classification methods

3 討論

對金花茶組22個物種花朵所測的9種多酚組分中，EC含量最高，多數物種EC含量占多酚總量的比例超過50%，其次是EGC、GCG、ECG，多酚總量也主要與這4種組分呈極顯著正相關；GA、GC則在多個樣品中未檢測到，且總體含量極低。此結果與茶葉的差別較大，茶樹中EGCG的含量最高[26]，在黑茶中GA與EGCG的含量很高[6]。另外，武鳴金花茶花朵的多酚總量也較高，但其組分組成與其它物種差別較大，EC含量占多酚總量比例較小，含量最高的組分為C。3類器官中，除GCG、ECG、CG在各物種的3類器官中均檢測到，其它組分在多個物種的不同器官中未檢測到，多數組分（EGC、C、EC、EGCG、GCG、ECG）及多酚總量，均為萼片中的含量最高，依次大于雄蕊、花瓣中的含量。雄蕊中GA、GC的含量依次大于萼片、花瓣中的含量，CG含量在花瓣中最高，依次大于雄蕊、萼片中的含量。

所測22個物種中，凹脈金花茶花朵的3類器官多酚總量最高為11.218 mg·g-1，平果金花茶與東興金花茶含量相近且最低，分別為2.312、2.351 mg·g-1。蘇建睦等[27]曾利用分光光度計測定3種金花茶的多酚總量，其結果比本研究略高，本實驗中未測定雌蕊的多酚含量。陳紅娟等[28]曾利用超高效液相色譜-電噴霧離子化-飛行時間質譜法（UPLC-ESI-Triple TOF MS）鑒定金花茶花中的多酚組分，共鑒定96種組分，除本試驗測定的9種主要組分外，其它組分也占一定比例，故本實驗所測含量略低。

目前，關于金花茶植物分類的爭議仍較大，閔天祿[17]和Wu等[18]的分類系統中認為，金花茶不應單獨成組，應歸并到古茶組中，但葉創興等[15]、梁盛業[16]、張宏達等[8]認為，應單獨設立金花茶組。關于模式種的選擇也不確定，閔天祿[17]和Wu等[18]選用C. petelotiiwei(Merr.) Sealy為模式種，葉創興等[15]、張宏達等[8]選擇C. nitidissimaChi為模式種，而梁盛業[16]則選擇C. chrysantha(Hu) Tuyama為模式種。各分類系統關注的分類依據也不盡相同，導致金花茶分類系統仍不統一。本研究對比了幾個形態分類系統與多酚組分含量的聚類結果，其中，花瓣多酚組分的聚類結果更傾向葉創興等[15]的分類系統，所測11個物種中9個物種與其分類相同。雄蕊多酚組分的聚類結果與各分類系統的相似率均較高，其中與葉創興等[15]的分類系統相似率最高，所測10個物種中9個物種均相同。萼片多酚組分的分類結果也與葉創興等[15]的分類系統相似率最高，所測9個物種中8個物種均與葉創興等[15]的分類系統相同。因此，本研究更支持葉創興等[15]的分類系統。

本研究3類器官多酚組分的聚類結果中，雄蕊聚類結果與各形態學分類結果相似率均較高，達到80.00%～90.00%，且雄蕊多酚組分的聚類分析與各分類系統重復的物種數量較多。故雄蕊多酚組分的聚類結果可以較完整地反映形態學分類結果，是對金花茶表型分類的有效補充。

4 結論

金花茶花朵花瓣、雄蕊、萼片3類器官所測的9種多酚組分中，EC含量最高，其次為EGC、GCG和ECG，這4種組分是多酚總量的主要成分。在3類器官中，多酚總量及EGC、C、EC、EGCG、GCG、ECG 6種組分含量的排序為：萼片＞雄蕊＞花瓣。雄蕊多酚組分的聚類結果可以較完整地反映形態學分類結果，是對金花茶表型分類的有效補充。