CRISPR/Cas9技術在園藝作物中的研究進展

黃少勇 ,王 娟 ,王柏柯 ,李 寧 ,唐亞萍 ,楊生保 ,楊 濤 ,張國儒 ,帕提古麗·艾斯木托拉 ,高 杰,余慶輝

(1．新疆農業大學林學與園藝學院，烏魯木齊 830091；2.新疆農業科學院園藝作物研究所，烏魯木齊 830091)

0 引 言

【研究意義】盡管園藝作物產量在不斷增加，但是品種的多樣性和營養價值卻在下降[1]。由于長期的馴化育種導致園藝作物遺傳多樣性變得狹窄以及野生近緣種的基因交流受到抑制而導致生殖隔離。獲得具有多樣性和理想特性的遺傳資源是園藝作物品種改良的重要環節。傳統育種在很大程度上依賴于現有的自然等位基因變異,或通過化學誘變劑或輻射來產生突變體[2]，作物改良過程費時又費力。與傳統育種技術相比，重組DNA技術允許將所需基因轉移到園藝作物中，為作物提供新的基因型和表型，從而提高產量，提升作物品質，增強逆境適應能力，延長貨架期等。其中CRISPR/Cas9技術，可以快速有效地改善重要的農藝性狀，如生物和非生物脅迫的響應能力以及作物果實品質等。一方面隨著越來越多植物基因組測序完成，為園藝作物的基因定位、結構與功能分析研究奠定了基礎，同時也為園藝作物改良提供重要參考信息。另一方面，不同園藝作物之間的巨大差異使得CRISPR/Cas9技術需要不斷地進行改良。園藝作物之間、甚至植物與動物之間的CRISPR/Cas9技術也可以相互借鑒與改進。【前人研究進展】CRISPR/Cas9技術在植物中的研究多集中在模式植物如擬南芥、水稻、煙草和番茄等，而在園藝作物中，如紅薯[3]、蘑菇[4]、蘋果[5]、柑橘[6]和馬鈴薯[7]等也有不少的研究報道。【本研究切入點】關于CRISPR/Cas9技術在園藝作物中的研究報道逐年增多，技術本身也在不斷改進。回顧近年來基因編輯技術在園藝作物中的研究進展。【擬解決的關鍵問題】總結近年來園藝作物中CRISPR/Cas9技術的研究現狀與發展趨勢,為園藝作物品種改良提供參考。

1 材料與方法

1.1 材 料

通過查閱國內外相關文獻資料，收集與園藝作物相關的CRISPR/Cas9前沿技術研究報道。

1.2 方 法

整理匯總，并分析園藝作物的CRISPR/cas9技術研究進展。

2 結果與分析

2.1 CRISPR的發現及其作用機理

2.1.1 CRISPR的發現與分類

1987年，荷蘭科學家首次在大腸桿菌基因組中發現CRISPR系統，用于防御噬菌體和外源質粒的入侵[8]。2005年，3個不同的研究團隊同時發現，許多CRISPR間隔子的短序列與來源于染色體外DNA的序列高度同源，表明CRISPR與特異性免疫之間存在一定的關系[9-11]。

一個完整的CRISPR/Cas系統由3部分組成：CRISPR序列、富含AT堿基的先導序列和可編碼cas蛋白的cas基因操縱子[12]。通常根據Cas蛋白的不同，CRISPR/Cas系統可分為3種主要類型：I型和III型系統使用的是大型多核蛋白質復合物進行靶向與結合，而II型系統只需要1種蛋白質，即Cas9 (CRISPR-associated protein 9)，該蛋白質用于RNA引導的雙鏈DNA的識別和斷裂，形成RuvC和HNH 2個不同的區域[13]。Cpf1是第2類V型CRISPR系統中的另1種核酸內切酶，在植物基因組編輯中也同樣有效[14]。由于作用機制的不同，每一種用于基因組編輯的核酸內切酶都具有獨特的特性。

2.1.2 CRISPR/Cas9的作用機理

一般來說，CRISPR/Cas9系統對外來DNA的作用可分為3個階段：一是獲得階段，識別入侵的DNA，并將從靶DNA衍生的間隔序列插入宿主CRISPR序列用于建立免疫記憶；二是表達階段，Cas9蛋白被表達，CRISPR序列被轉錄成前體RNA轉錄本(pre-crRNA)。隨后1個非編碼反式激活的CRISPR RNA (crRNA)與pre-crRNA和Cas9蛋白結合，將它們加工成成熟的RNA，即crRNAs；3是干擾階段，成熟的crRNAs引導Cas9蛋白識別合適的DNA靶點，然后切割并降解入侵的外源DNA[15]。

Cas9蛋白切割DNA產生1個DSB (double-strand break site, 雙鏈斷裂位點)，從而觸發細胞DNA修復機制。在缺乏同源修復模板的情況下，易錯的NHEJ (non-homologous end joining, 非同源末端連接)途徑被激活，并在DSB位點引入隨機的插入，刪除甚至替換，這種方式通常會導致基因功能的缺失。另外，如果獲得與DSB位點周圍序列同源的供體DNA模板，則會激活精確的HDR (homology-directed repair, 同源重組修復)途徑，執行精準的基因修飾突變，包括基因敲入、刪除或突變[16]。目前，最常用的Cas9蛋白來自化膿鏈球菌(Streptococcuspyogenes, Sp)。利用該系統進行基因組編輯，需要合成單鏈向導RNAs (single-guide RNAs, sgRNAs)來構建CRISPR/cas9表達盒。然后，通過識別NGG的PAM(protospacer adjacent motif, 前間區序列鄰近基序)的sgRNAs引導Cas9蛋白到特定的基因組位點，并匹配目標DNA序列[17]。

自2013年成功利用CRISPR/Cas9系統編輯植物基因組以來，已經將其轉化為更強大的工具。目前，CRISPR/Cas9具有多基因編輯功能，即1次編輯多個基因[18]。此外，CRISPR/Cas9不僅可以靶向1個編碼基因的開放閱讀框(ORF)[19]和非編碼區[20]，還可以靶向包括長鏈非編碼RNA (ncRNA)、microRNA[21]及啟動子區[22]。還可以在不需要DSB的情況下，在基因組靶點上實現單堿基替換[23]。

2.2 CRISPR/Cas9技術在園藝作物中的應用

2014年，CRISPR/Cas9系統首次在番茄中應用，研究人員將Argonaute7基因敲除后使番茄葉片產生Wiry表型[24]。隨著CRISPR/Cas9技術的發展，在越來越多的園藝作物中得到應用，包括草莓[25]、香蕉[26]、葡萄[27]、蘋果[28]、西瓜[29]和獼猴桃[30]。該文總結了CRISPR/Cas9在番茄等園藝作物上的研究應用，主要包括：影響植物生長發育、提高果實品質、響應生物與非生物脅迫，以及作物馴化等。表1

表1 CRISPR/Cas9在番茄等園藝作物上的應用

2.2.1 影響植物生長發育

草莓作為1種模式生物，常被用于特定基因的功能分析。利用CRISPR/Cas9技術敲除草莓ARF8 (auxin response factor 8, 生長素響應因子8)，證實arf8純合突變體比野生型植株幼苗生長快[25]。據報道，番茄TM6基因(tomato MADS-box gene 6)在雄蕊發育過程中起主要作用[31]。為了證明其在草莓中的功能，利用CRISPR/Cas9系統構建1個八倍體的tm6突變體進行表型分析，發現其花藥存在嚴重缺陷，表明TM6在草莓花發育中同樣起著重要作用[32]。此外，利用CRISPR/Cas9策略研究YUCCA10 (YUC10)基因在草莓果實發育的生長素合成過程中的生物學作用。當敲除YUC10時，在yuc10突變體中觀察到游離生長素顯著減少[33]。除了草莓的功能性研究外，越來越多的研究人員正致力于CRISPR/Cas9介導的基因組編輯研究，以期改良其它園藝作物。

成功構建了靶向TCS (tea caffeine synthase, 咖啡堿合成酶)的CRISPR/Cas9基因編輯載體，為茶樹其他基因的CRISPR/Cas9基因編輯載體的構建，提供了借鑒方法[34]。研究發現，楊樹AZF2 (Arabidopsis zinc-finger protein 2, 擬南芥鋅指蛋白2)基因可能參與了根的發育。利用CRISPR/Cas9方法將新疆楊PalAZF2定點敲除，構建palazf2新疆楊突變體植株。研究發現，敲除PalAZF2的突變體植株的生根速度減慢，推測PalAZF2基因與根的生長有關，參與調控新疆楊的生長發育[35]。CRISPR/Cas9技術在重要農藝性狀改良方面同樣具有巨大的優勢。以甘藍BoPDS(Phytoene desaturase, 八氫番茄紅素脫氫酶)為靶基因，利用CRISPR/Cas9系統實現甘藍基因組的精準編輯。在轉基因T0代植株中觀察到白化的葉片表型，37.5%的轉基因植株在BoPDS基因預期位置上發生核苷酸缺失突變。在BoPDS的同源基因Bol016089中也檢測到在相應位置上發生突變。研究結果表明，CRISPR/Cas9系統可作為有效改良甘藍品種的基因編輯工具[36]。

2.2.2 提高果實品質

果實品質既包括果實大小，顏色和貨架期等外在品質，也包括口感風味與營養物質等內在品質。在番茄果實中，花心皮產生的子房室數對番茄果實大小影響最大[37]。經典的CLAVATA-WUSCHEL(CLV-WUS)干細胞通路可以調控番茄的心室數。利用CRISPR/Cas9技術誘導番茄SlCLV3啟動子突變，獲得的轉基因植株比野生型植株具有較多的心室和較大的果實[38]。利用CRISPR/Cas9技術分別以PSY1 (phytoene synthase 1，八氫番茄紅素合成酶1)、MYB12 (MYB transcription factor 12, MYB轉錄因子12)和ANT2 (Anthocyanin 2, 花色苷2)為靶位點，成功地培育出黃色[39]、粉紅色[40]和紫色[41]番茄。通過CRISPR/Cas9技術可以使RIN(ripening inhibitor)[42]或者DML2 (DNA demethylase 2)[43]失活，延緩果實的成熟時間，從而延長貨架期。有研究報道，在不降低番茄口感和營養品質的情況下，通過沉默PL (pectate lyase, 果膠裂解酶)[44]和ALC (alcobaca)[45]成功地控制果實的軟化，這表明CRISPR/Cas9系統將是園藝作物果實品種改良的一個重要工具。

已有報道利用CRISPR/Cas9技術通過調節其代謝途徑中關鍵基因的表達來提高果實中花青素(Anthocyanin)[46]、γ-氨基丁酸(γ-aminobutyric acid, GABA)[47]和番茄紅素(lycopene)[48]的含量。此外，研究人員還利用CRISPR/Cas9鑒定到番茄中蘋果酸(malate)含量的關鍵調控基因ALMT9 (aluminum-activated malate transporter 9, 鋁激活蘋果酸轉運蛋白)[49]。

2.2.3 響應生物與非生物脅迫

園藝作物通常面臨各種生物與非生物的脅迫，隨著基因編輯技術的飛速發展，特別是CRISPR/Cas系統的建立，為植物抵御各種脅迫提供了新方法[50,51]。通過定位外殼蛋白和基因組的復制酶位點，利用CRISPR/Cas9系統對抗番茄黃葉卷曲病毒進行了基因工程設計。發現編輯的番茄植株比野生型番茄表現出高效的病毒抗性，積累的病毒基因組DNA較少，且這種免疫活性可以世代傳遞[52]。通常，植物RNA病毒需要宿主因子以維持其生命周期，如eIF4E(eukaryotic translation initiation factor 4E)。利用CRISPR/Cas9系統構建突變體破壞eIF4E的功能，對黃瓜葉脈黃變病毒、西葫蘆黃花葉病毒和番木瓜環斑花葉病毒均具有免疫功能[53]。此外，敲除番茄DCL2 (Dicer-like 2)基因，獲得的dcl2突變體在感染馬鈴薯X病毒(potatovirusX,PVX)、煙草花葉病毒(tobaccomosaicvirus,TMV)和番茄花葉病毒(tomatomosaicvirus,ToMV)時表現出相應癥狀，說明DCL2參與了對RNA病毒的防御[54]。利用CRISPR/Cas9技術使內源性香蕉條紋病毒(endogenousbananastreakvirus,eBSV)失活，發現與未經編輯的對照組相比，75%的被編輯植株無癥狀表現[55]。

在擬南芥中，DMR6 (downy mildew resistant)屬于2-氧戊二酸鐵(II)依賴氧合酶超家族成員，參與水楊酸的內穩態，過表達AtDMR6后，轉基因植株對霜霉病的敏感性增強[56]。而利用CRISPR/Cas9技術對番茄DMR6同源基因突變，發現dmr6突變體對丁香假單胞菌(Pseudomonassyringae)、辣椒疫霉、黃單胞菌在內的多種病原菌均表現出了抗病性，且該突變對植株無危害[57]。Mlo1 (Mildew resistant locus O 1)編碼一種膜相關蛋白，對引起白粉病的真菌具有敏感性。利用CRISPR/Cas9技術獲得mlo1功能缺失的番茄突變體，發現該突變體對白粉病真菌(Oidiumneolycopersici)具有完全抗性[58]。值得注意的是，通過自交轉化株T0將轉移DNA (T-DNA)分離，并在子代中鑒定到無T-DNA插入的mlo1突變體，這些突變體被認為是無轉基因作物。MLO7 (mildew resistance locus O 7)和WRKY52 (WRKY transcription factor 52)分別與白粉菌(Erysiphenecator)和灰霉病菌(B.cinereal)抗性相關。Malnoy等[59]和Wang等[60]分別在蘋果和葡萄中，利用CRISPR/Cas9系統獲得的功能缺失突變體對白粉菌和灰霉病菌免疫性增強。番茄果實極易感染灰霉病，利用CRISPR/Cas9技術敲除掉MAPK3 (Mitogen-activated protein kinase 3)后，間接增強SlJAZ1和SlMYC2的表達，從而證明MAPK3在番茄抗灰霉病中起著積極的作用[61]。柑橘潰瘍病是由柑橘潰瘍病菌(Xanthomonas citri)引起的，通過CRISPR/Cas9編輯柑橘LOB1 (lateral organ boundaries 1)的啟動子區域獲得抗柑橘潰瘍病的突變植株對柑橘潰瘍病表現出高度的抗性[62]。

通常BZR1 (Brassinazole resistant 1)調節油菜素內酯(brassinosteroid, BR)反應，參與BR介導的發育過程。研究人員在番茄中利用CRISPR/Cas9系統構建CRISPR-bzr1突變體，證實BZR1還通過調節細胞膜受體蛋白激酶FERONIA (FER)基因參與番茄的耐熱性[63]。同時，番茄也是1種對低溫敏感的作物，其果實品質容易受低溫脅迫影響。研究發現CBF1 (C-repeat binding factor 1)保護植物免受凍害，通過CRISPR/Cas9獲得的cbf1突變體表現出比野生型植株更嚴重的凍害癥狀[64]。此外，MAPK3不僅具有番茄灰霉病抗性，還能通過保護細胞膜免受氧化損傷的方式參與番茄的干旱脅迫響應[65]。

2.2.4 作物的馴化

從野生植物演變為栽培作物的過程叫做植物馴化。傳統的園藝作物馴化方式是經過長期的人工選擇獲得理想表型。而CRISPR/Cas9則可以加快引種馴化的過程。作物產量很大程度上取決于花的數量，而花序結構決定花的數量。在番茄中，多花花序的形成依賴于轉錄因子TMF(TERMINATING FLOWER)的精確調控，研究發現TMF蛋白和3個番茄BOP (blade-on-petiole)同源基因相互作用，形成轉錄復合物。利用CRISPR/Cas9分別構建CR-slbop1/3、CR-slbop1/2、CR-slbop2/3等雙突變體和CRISPR-bop1/2/3三突變體，這些缺失突變體花序都極其簡化。證明SlBOP與其同源基因功能相似，影響花序結構，特別是CRISPR-bop1/2/3三突變體的開花速度比野生型快，但具有極其簡化的花序[66]。單性結實是園藝作物理想的農藝性狀，利用CRISPR/Cas9敲除番茄的AGL6 (AGAMOUS-LIKE 6)基因獲得突變體為單性結實表型，由于該突變不會對果實的重量和外形有影響，沒有引起同源基因的變化，因此，AGL6是單性結實的一個理想基因[67]。赤霉素或生長素信號的升高可誘導植物的單性結實，由參與生長素信號通路的IAA9 (indole-3-acetic acid inducible 9)和ARF7 (auxin response factor 7)基因敲除產生的突變體均為單性結實[68]。此外，番茄果實的果柄無分離層更便于機械化采收，育種家們利用CRISPR/Cas9技術培育出番茄MBP21 (MADS-box protein 21)功能缺失的突變體mbp21為無果節表型[69]。過去要通過漫長的人工馴化工作才能獲得這些理想的園藝作物表型，現在通過CRISPR/Cas9體系可以更快捷，高效的將其引入園藝作物中。

通過CRISPR/Cas9技術還可以將理想的農藝性狀引入野生植物中，從頭馴化野生種是另1種有效的園藝作物馴化策略。利用多重CRISPR/Cas9技術編輯編碼序列、順式調控區或上游開放閱讀框，將與形態、花果產量和抗壞血酸合成相關的理想性狀引入4個耐脅迫野生番茄材料中。不含Cas9基因的編輯植株后代具有馴化的表型，但仍保持了親本的抗病性和耐鹽性[70]。姑娘果是1種生長在中美洲和南美洲的野生茄科植物，利用CRISPR/Cas9，分別將3種控制株型、花量和果實大小的番茄同源序列(SP, SP5G和CLV1)引入姑娘果中，從而改善了姑娘果的主要農藝性狀[71]。應用CRISPR/Cas9技術，通過引入遠緣模式植物的已知農藝性狀來加速各種野生植物的馴化過程成為了可能。

3 討 論

3.1 盡管CRISPR/Cas9系統本身還存在編輯效率低、脫靶風險高等缺點，在各種園藝作物中建立高效的CRISPR/Cas9體系還存在許多局限和挑戰，但是隨著研究人員對CRISPR/Cas9體系不斷研究發現，影響CRISPR/Cas9系統編輯效率的主要因素包括2個重要元件(Cas9和sgRNA)。因此，對Cas9蛋白的改造以及提高sgRNA的特異性是提高編輯效率，降低脫靶風險的有效途徑。

3.2 對Cas9進行改造，使其中1個結構域失活，得到突變型D10A Cas9切口酶和H840A Cas9切口酶。Cas9蛋白經過這一改造，CRISPR/Cas9技術應用時就需要設計2條sgRNA，該策略可使脫靶效應降至1/1 000[72]。科研人員對Cas9稍加改動，使其迅速擴增，積累突變，再識別PAM序列并對臨近DNA進行切割，最終獲得CRISPR/Cas9不僅提高了編輯效率，同時還降低了脫靶風險[73]。將CRISPR/Cas9系統中Cas9的2個保守的內切核酸酶結構域進行突變，使Cas9蛋白失去內切核酸酶活性，稱之為dead Cas9 (dCas9)。dCas9不能切割DNA但仍能與sgRNA形成復合物并與特定DNA序列結合。該系統不會造成DNA雙鏈斷裂，可避免在特定基因上的永久突變對宿主的影響。尤其是在調控基因表達中的作用，既可用于激活特定基因的表達(CRISPR activation, CRISPRa)，也可用于抑制特定基因轉錄(CRISPR interference, CRISPRi)。可用于實現對園藝作物表觀基因組更好的控制[74]。

3.3 在提高sgRNAs特異性方面，成功構建了1種基于靶向差異sgRNAs的代理報告系統(Discriminated sgRNAs based SurroGate system, DisSUGs)，實現了對胞嘧啶堿基編輯器(cytosine base editor, CBE)或腺嘌呤堿基編輯器(adenine base editor, ABE)編輯后細胞的高效富集。經DisSUGs系統篩選后，平均75%的再生植株都實現了堿基編輯，比常規編輯方法提高了3～5倍，其中ABE的效率平均可以達到81%左右[75]。近期報道，在大豆中通過篩選高效sgRNA，提升編輯效率的策略。設計了70個sgRNA靶向102個大豆基因，通過16次轉化得到407個T0株系，覆蓋所有sgRNA，多數sgRNA有3個以上獨立株系，整體基因編輯效率為59.2%，其中35.6%為多基因突變[76]。隨著CRISPR/Cas9體系的不斷成熟完善，越來越多園藝作物CRISPR/Cas9系統的成功構建，該技術在生產實踐上的應用范圍將越來越廣。

4 結 論

回顧近年來運用CRISPR技術在園藝作物的生長發育、果實品質、響應各類脅迫和作物馴化等方面的主要成就，尤其是利用CRISPR技術編輯的作物原生質體中無外源DNA傳遞，可以快速高效地獲得理想表型的園藝作物新品種，加快具有優良表型的園藝作物培育生產。園藝作物種類繁多，但是其中大部分園藝作物的遺傳信息仍然缺乏。隨著全基因組與泛基因組等測序工作的不斷完成，越來越多的園藝作物遺傳信息得以闡明。基于重要農藝性狀(如抗逆、抗病、花期、育性和高度等)基因定位信息不斷完善，以及對決定園藝作物性狀的主要基因的挖掘，構建不同園藝作物的CRISPR/Cas9體系，將加快園藝作物在基礎研究和應用生產上的發展。