薰衣草DXS基因的克隆、表達(dá)分析及原核表達(dá)

龔林濤，蘇秀娟，尹松松，孫明輝，閆博文，阿迪萊·阿布都熱依木,陳全家

(新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院 / 新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)業(yè)生物技術(shù)重點(diǎn)實驗室，烏魯木齊 830052 )

0 引 言

【研究意義】薰衣草為唇形科薰衣草屬(Lavandula)。我國主要栽培的薰衣草種有狹葉薰衣草(LavandulaangustifoliaMil1.)、闊葉薰衣草(LavandulalatifoliaVill.)、雜薰衣草(Lavandulaxintermedia)[1]。新疆是薰衣草的主要種植地區(qū)，薰衣草花穗提取的精油具有抗菌、鎮(zhèn)靜、助眠、緩解疼痛等功效[2]，被廣泛應(yīng)用于日化用品、化妝品、香薰等領(lǐng)域。薰衣草精油由多種化合物組成，其中萜類化合物占比最高，其主要組分為芳樟醇、乙酸薰衣草酯、乙酸芳樟酯、1,8-桉葉醇、羅勒烯、樟腦等單萜類化合物[3]。植物的萜烯類物質(zhì)的合成有2個途徑，一個是存在于胞質(zhì)中的甲羥戊酸(MVA)途徑[4]，另一個是存在于質(zhì)體上的甲基赤蘚糖醇途徑(MEP)[5]，而單萜類化合物主要由MEP途徑合成[6]。DXS是催化MEP途徑第一步反應(yīng)的重要限速酶，催化丙酮酸和3-磷酸甘油醛合成1-脫氧-D-木酮糖-5-磷酸(1-deoxy-Dxylulose-5-phosphate，DXP)[7]。DXS在植物萜類產(chǎn)物的形成和代謝中起到重要作用。揭示DXS基因在薰衣草萜類物質(zhì)合成過程中的調(diào)控作用，可為利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)培育優(yōu)質(zhì)薰衣草品種提供理論基礎(chǔ)。 【前人研究進(jìn)展】Jiang R[8]構(gòu)建可產(chǎn)生擬紫羅蘭酮的菌株時，向大腸稈菌中轉(zhuǎn)入含有DXS基因的重組質(zhì)粒，使擬紫羅蘭酮的產(chǎn)量增加了8.34倍。Berry[9]發(fā)現(xiàn)DXS基因轉(zhuǎn)錄水平與類胡蘿卜素的積累有直接關(guān)系，從而影響辣椒的顏色強(qiáng)度。共表達(dá)煙草DXS基因和SPS(茄尼基焦磷酸合酶)基因，轉(zhuǎn)基因植株茄尼醇的含量最高提升了3倍左右，苗期DXS基因表達(dá)量最高是對照的10.2倍[10]。Vaccaro等[11]發(fā)現(xiàn)，過表達(dá)藍(lán)細(xì)菌DXS基因可使丹參菌核毛根部產(chǎn)生大量的生物活性二萜，其中衣索酮的產(chǎn)量提高了3倍左右。Wei Hui等[12]將胡楊PtDXS基因?qū)氚讞顦渲邪l(fā)現(xiàn)：相比野生型，轉(zhuǎn)基因白楊中脫落酸和赤霉素含量較高。DXS基因除具有可以調(diào)控萜類代謝的功能，還與植物抗病性有關(guān)[13]。 【本研究切入點(diǎn)】DXS基因在萜類合成代謝中具有重要的作用，目前在薰衣草萜類合成代謝過程中的調(diào)控作用尚未報道。研究DXS基因分子特性和表達(dá)模式，了解其在薰衣草萜類合成代謝過程中的調(diào)控作用，揭示其在薰衣草萜類代謝途徑上的分子機(jī)理。 【擬解決的關(guān)鍵問題】以高油薰衣草品系雜花為材料，克隆并分析DXS基因，比較DXS基因在低油薰衣草品系法國藍(lán)和高油薰衣草品系雜花的花器官的時空表達(dá)，并對該基因進(jìn)行原核表達(dá)分析。系統(tǒng)分析DXS基因分子特性以及表達(dá)特性，研究該基因在薰衣草萜類代謝通路中的調(diào)控機(jī)制，為培育優(yōu)質(zhì)薰衣草品種提供優(yōu)異基因資源和理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 薰衣草

試驗以新疆伊犁地區(qū)種植的薰衣草品系雜花和法國藍(lán)為材料。

1.1.2 載體和試劑

pET-28a(+)、pCAMBIA1304保存于新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)生物技術(shù)重點(diǎn)實驗室；大腸稈菌DH5α感受態(tài)、pEASY-T5 Simple Cloning Kit 、TransStart?FastPfu Fly DNA Polymerase、TransStartTip Green qPCR SuperMix (+Dye I)、ProteinRuler?II、Transetta(DE3)感受態(tài)購自北京全式金生物技術(shù)有限公司；多糖多酚植物總RNA提取試劑盒、普通瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒購自北京天根生化科技有限公司；核酸染料、農(nóng)稈菌GV3101感受態(tài)購自北京博邁德生物技術(shù)有限公司；2×TaqMaster Mix、MarkerⅦ、Marker 15 000購自北京酷來搏科技有限公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒、限制性內(nèi)切酶NdeⅠ、EcoRⅠ、T4DNA 連接酶購自賽默飛世爾科技有限公司；引物合成和測序由昆泰銳生物技術(shù)有限責(zé)任公司完成。LB培養(yǎng)基：每升培養(yǎng)基含胰蛋胨10 g，酵母提取物5 g，氯化鈉10 g，固體培養(yǎng)基含瓊脂15 g。

1.2 方 法

1.2.1 基因克隆

根據(jù)NCBI公布的狹葉薰衣草1-脫氧-D-木酮糖-5-磷酸合成酶核苷酸序列(登錄號：JX630150.1)，設(shè)計特異性引物(F1: ATGGCGTCTTGTGGAGTTTT、R1: TTAAGATGACAGGTTGATGAAACG)。提取雜花葉片RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA作為模板，擴(kuò)增該目的基因。反應(yīng)體系：cDNA 1 μL，上下游引物各1 μL，2.5 mM dNTPs 5 μL，10×EasyPfuBuffer 5 μL，EasyPfuDNA Polymerase 1 μL，water 36 μL。反應(yīng)條件：94℃ 5 min，94℃ 30 s，60℃ 40 s，72℃ 2 min，35個循環(huán)，72℃ 10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳回收后，用pEASY-T5載體連接，菌液PCR鑒定陽性克隆，送測昆泰銳生物技術(shù)有限責(zé)任公司。

1.2.2 生物信息學(xué)

利用生物信息學(xué)網(wǎng)絡(luò)平臺NCBI網(wǎng)站提供的Blastp程序?qū)幋a蛋白進(jìn)行相似性搜索。使用ProtParam在線程序計算編碼蛋白的理化參數(shù)。使用EMBL的InterProScan及Pfam對推導(dǎo)出的蛋白功能結(jié)構(gòu)域進(jìn)行預(yù)測。使用 PSIPRED在線工具預(yù)測該蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)。使用SWISS-Model在線程序的自動模式對該蛋白的三級結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測分析。使用Clustal X和MEGA 5.0完成多種氨基酸序列比對及相關(guān)蛋白的同源樹構(gòu)建。

1.2.3 表達(dá)模式

取雜花和法國藍(lán)花器官不同發(fā)育時期的花冠：花蕾期、初開期、半開期、盛開期、衰敗期；花器官盛開期的不同組織：花冠、花萼、萼片、雄蕊、雌蕊，提取RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA；設(shè)計用于表達(dá)分析的特異性引物(F2: GCACGATGTGGACCTTCAGA、R2: CCGCCCGGTCCATCA；以β-Actin(F3: TGTGGATTGCCAAGGCAGAGT、R3: AATGAGCAGGCAGCAACAGCA)基因為內(nèi)參，利用熒光定量PCR技術(shù)分析DXS基因在薰衣草不同品系花器官的不同發(fā)育時期及不同組織中的表達(dá)模式。

1.2.4 原核表達(dá)

設(shè)計含有NdeⅠ、EcoRⅠ酶切位點(diǎn)的克隆引物(F4: GGAATTCATATGATGGCGTCTTGTGGAGTTTT、R4: CGGAATTCAGATGACAGGTTGATGAAACG)，酶切擴(kuò)增產(chǎn)物及pET-28 a(+)載體，瓊脂糖凝膠電泳后回收純化目的基因及線性載體，T4連接酶連接后轉(zhuǎn)化DH5α，鑒定陽性克隆，送測昆泰銳生物技術(shù)有限責(zé)任公司，抽提質(zhì)粒轉(zhuǎn)化Transetta(DE3)感受態(tài)?；罨?0 μL pET-28 a(+)-DXS菌液至5 mL LB培養(yǎng)基中37℃，220 r/min，12 h，將活化菌液500 μL加入15 mL LB培養(yǎng)基中至OD600在0.4～0.6，1 mL使用含終濃度0、0.1、0.5、0.8、1、1.5和2 mM IPTG的LB培養(yǎng)基37℃誘導(dǎo)8 h，菌液沉淀使用120 μL去離子水重懸后加入30 μL 5×蛋白上樣緩沖液，100℃煮沸10 min。

1.3 數(shù)據(jù)處理

使用DNAMAN軟件對DXS基因序列進(jìn)行分析，使用ProtParam在線程序?qū)幋a蛋白的理化參數(shù)進(jìn)行分析，使用EMBL的InterProScan及Pfam在線預(yù)測軟件、PSIPRED在線預(yù)測軟件、SWISS-Model在線程序?qū)XS蛋白結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測，使用Clustal X和MEGA 5.0完成多種氨基酸序列比對及蛋白同源樹構(gòu)建，使用Excel 2013、GraphPad Prism對DXS基因在雜花、法國藍(lán)花器官不同發(fā)育時期、不同組織的實時熒光定量PCR數(shù)據(jù)進(jìn)行分析和作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 DXS基因克隆

以薰衣草雜花cDNA為模板，擴(kuò)增出DXS基因。雜花DXS基因的ORF長2 181 bp，編碼1條由726個氨基酸組成的蛋白質(zhì)序列。使用ProtParam在線程序計算雜花DXS基因編碼蛋白的理化參數(shù)。研究表明，該蛋白質(zhì)等電點(diǎn)為6.57，分子量約為78.39 KDa。圖1

注：M：Marker Ⅶ；1：PCR擴(kuò)增Note: M: Marker Ⅶ; 1: PCR amplification圖1 DXS基因擴(kuò)增電泳Fig.1 Agarose gel electrophoresis of DXS gene

該蛋白質(zhì)序列含有DXP_synthase_N結(jié)構(gòu)域、Transket_pyr和Transketolase_C結(jié)構(gòu)域，預(yù)測該蛋白屬于TPP_enzyme超家族成員、Transketolase_C超家族成員。圖2

圖2 DXS蛋白的功能結(jié)構(gòu)域Fig. 2 Conserved domains in DXS protein

DXS蛋白二級結(jié)構(gòu)包含29個β-折疊和20個α-螺旋。使用SWISS-Model在線程序的自動模式對DXS蛋白的三級結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測分析。發(fā)現(xiàn)該蛋白三級結(jié)構(gòu)中含有GCC元件結(jié)合結(jié)構(gòu)域(SMTL ID 2o1x.1 B)，相似性達(dá)到41.31%以上。圖3

圖3 DXS蛋白二級結(jié)構(gòu)預(yù)測Fig. 3 Predicted secondary structure of DXS protein

狹葉薰衣草(Lavandulaangustifolia)、冬凌草(Isodonrubescens)、毛喉鞘蕊花(Plectranthusbarbatus)、一串紅(Salviasplendens)、鼠尾草(Salviaofficinalis)、丹參(Salviamiltiorrhiza)、野茶樹(Camelliasinensis)、毛花連蕊茶(Camelliafraterna)、獼猴桃 (Actinidiachinensis)、萬壽菊(Tageteserecta)中的DXS蛋白序列具有高度的保守性；構(gòu)建相關(guān)蛋白的同源樹，DXS蛋白和狹葉薰衣草、冬凌草、毛喉鞘蕊花DXS蛋白親緣關(guān)系相近。圖4～6

圖4 DXS蛋白三級結(jié)構(gòu)預(yù)測模型
Fig. 4 Predicted 3D structure model of DXS protein

注：圖中分支點(diǎn)的數(shù)值表示Bootstrap 驗證中基于1 000次重復(fù)的置信度Note: The numerical values of the branch points in the graph represent the confidence of the bootstrap validation based on 1,000 repetitions圖5 DXS蛋白的系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig. 5 Phylogenetic tree analysis of DXS protein

圖6 雜花DXS蛋白與其他物種DXS蛋白序列比對Fig. 6 Multiple alignment of amino acid sequences of DXS protein in Zahua

2.2 DXS基因的表達(dá)模式

研究表明，在2個品系花器官的不同發(fā)育時期和不同組織中均檢測到了DXS基因的表達(dá)。

DXS基因在雜花花蕾期、初開期的表達(dá)量差異不顯著(P>0.05)，初開期、半開期、盛開期、衰敗期花冠表達(dá)量呈現(xiàn)顯著遞增的趨勢；在法國藍(lán)花蕾期、初開期、半開期、盛開期4個時期表達(dá)量不斷上升，盛開期達(dá)到最高，衰敗期開始降低。DXS基因在雜花花萼中表達(dá)量最高，在法國藍(lán)盛開期雄蕊中表達(dá)量最高。圖7，圖8

圖7 DXS基因在雜花和法國藍(lán)花器官不同發(fā)育時期表達(dá)量Fig. 7 Expression analysis of DXS gene in Zahua and French Blue flower organs at different developmental stages

DXS基因在雜花和法國藍(lán)花器官不同發(fā)育時期、不同組織相對表達(dá)量也存在差異。DXS基因在雜花不同發(fā)育時期的表達(dá)量均高于該基因在法國藍(lán)不同發(fā)育時期的表達(dá)量；DXS基因在雜花的花冠、花萼、萼片的表達(dá)量均高于該基因在法國藍(lán)以上組織中的表達(dá)量，而該基因在雄蕊、雌蕊中的表達(dá)量均低于在法國藍(lán)中的表達(dá)量，DXS基因在雜花和法國藍(lán)花器官不同發(fā)育時期、不同組織中的表達(dá)模式存在差異。圖7，圖8

圖8 DXS基因在雜花和法國藍(lán)花器官不同組織中表達(dá)量Fig. 8 Expression analysis of DXS gene in Zahua and French Blue flower organs at different tissues

2.3 DXS基因原核表達(dá)

EcoRⅠ、NdeⅠ 酶切鑒定構(gòu)建的pET-28a(+)-DXS重組質(zhì)粒，酶切產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測，酶切后的小片段條帶大小與目的基因大小一致，回收小片段產(chǎn)物后測序結(jié)果與目的序列一致，證明載體構(gòu)建成功。將pET-28a(+)-DXS、pET-28a(+)空載體轉(zhuǎn)化Transetta(DE3)感受態(tài)細(xì)胞，通過對不同時間、不同溫度、不同誘導(dǎo)劑濃度的篩選進(jìn)行表達(dá)體系優(yōu)化，在37℃，誘導(dǎo)4 h，誘導(dǎo)劑IPTG濃度為0.8 mM時誘導(dǎo)量最大。圖9,圖10

注：M：Marker 15 000；1：pET-28a(+)-DXS質(zhì)粒經(jīng)NdeⅠ、EcoRⅠ雙酶切；2：pET-28a(+)-DXS線性質(zhì)粒Note: M: Marker 15,000; 1: pET-28a(+)- DXS digested by double enzyme NdeⅠ and EcoRⅠ;2: pET-28a(+)-DXS Linear plasmid圖9 原核表達(dá)載體 pET-28a(+)-DXS雙酶切鑒定Fig. 9 Identification of recombinant plasmid by double enzyme digestion

注：M：蛋白ProteinRuler Ⅰ ；1：pET-28a(+)未誘導(dǎo)；2：pET-28a(+)誘導(dǎo)后；3：pET-28a(+)-DXS蛋白誘導(dǎo)前；4：DXS蛋白未誘導(dǎo)；5：DXS蛋白誘導(dǎo)后Note: M: ProteinRuler Ⅰ; 1: Transetta with pET-28a(+) uninduced; 2: Transetta with pET-28a(+) induced by IPTG; 3: Transetta with pET-28a(+)-DXS before induction; 4: Transetta with pET-28a(+)-DXS uninduced; 5: Transetta with pET-28a(+)-DXS by IPTG圖10 DXS重組蛋白原核表達(dá)Fig.10 Prokaryotic expression analysis of recombinant DXS protein

3 討 論

DXS作為催化MEP途徑第1步反應(yīng)的重要限速酶，在植物萜類代謝中起到至關(guān)重要的作用，對DXS基因家族的研究引起了廣泛關(guān)注。研究表明，不同植物中DXS基因家族成員的數(shù)目各不相同，如雷公藤有2個DXS基因，沉香和擬南芥有3個DXS基因[14-15]，胡蘿卜(Daucus carota)[16]有5個DXS基因，煙草僅在茄尼醇合成途徑上就發(fā)現(xiàn)6個DXS基因[17]。研究目前僅從雜花薰衣草中克隆出1條DXS基因。

近10年來約有200個植物的DXS基因相繼被國內(nèi)外學(xué)者克隆，并對DXS基因的基因序列和蛋白結(jié)構(gòu)進(jìn)行了分析。研究中雜花DXS基因的蛋白含有726個氨基酸，與報道中大多數(shù)植物的DXS蛋白含有691～738個氨基酸的結(jié)論一致[18]。雜花薰衣草的DXS蛋白結(jié)構(gòu)高度保守，其對應(yīng)編碼的氨基酸序列與已登錄NCBI的狹葉薰衣草DXS氨基酸序列比較發(fā)現(xiàn)，雜花DXS在第510個氨基酸處多出1個脯氨酸，且雜花DXS全序列共有8處氨基酸序列存在差異。雜花的DXS與大多數(shù)植物DXS具有相同的特點(diǎn)，蛋白系統(tǒng)進(jìn)化樹分析表明，雜花的DXS蛋白與狹葉薰衣草DXS蛋白一致性最高，其次與唇形科香茶屬的冬凌草、唇形科鞘蕊屬毛喉鞘蕊花的DXS蛋白也有較高的一致性，而與菊科萬壽菊屬的萬壽菊DXS蛋白一致性最低，DXS同源蛋白序列間的差異，可能使其在不同物種中行使不同的生物功能。根據(jù)PredictProtein、TargetP蛋白在線預(yù)測軟件預(yù)測，亞細(xì)胞定位預(yù)測雜花DXS蛋白定位在葉綠體上，這與MEP途徑位于質(zhì)體上的報道一致。

DXS基因表達(dá)水平與品種有關(guān)，并具有組織差異性[19]。張浩宇等[20]發(fā)現(xiàn)DXS基因在香味越濃的百合品種中表達(dá)量越高；徐燕[21]發(fā)現(xiàn)5個不同茶樹品種葉芽中的DXS基因的表達(dá)量也有差異。Xu Chen等[22]在木本植物胡楊中發(fā)現(xiàn)，PtDXS在葉片中表達(dá)水平最高，在根中表達(dá)水平最低，烏頭[23]中AbDXS1基因，熊膽草[24]中CbDXS基因在葉片中的表達(dá)水平也高于在根中的表達(dá)水平。王輝等[25]發(fā)現(xiàn)，紅豆杉中的TcDXS在嫩葉柄表達(dá)最高，葉、皮次之，根、莖最低。DXS基因表達(dá)水平與組織發(fā)育程度也有關(guān)系，郭亞飛[26]發(fā)現(xiàn)，茶樹CsDXS1基因在葉片的不同發(fā)育時期存在表達(dá)差異，嫩葉中表達(dá)水平更高；鄭麗屏等[27]發(fā)現(xiàn)，黃花蒿DXS基因的表達(dá)水平花期植株顯著高于營養(yǎng)期植株。研究中，DXS基因在雜花、法國藍(lán)2品系中不同發(fā)育時期、不同組織中均有表達(dá)；在衰敗期雜花的表達(dá)量呈現(xiàn)上升的趨勢，法國藍(lán)的表達(dá)量呈現(xiàn)下降的趨勢；而從DXS基因在雜花不同發(fā)育時期、不同組織的表達(dá)量均高于法國藍(lán)，初步判斷DXS基因表達(dá)與薰衣草精油產(chǎn)量存在正相關(guān)關(guān)系。

DXS基因家族中每一條DXS可能僅作用于一個或幾個萜類成分的生物合成途徑，如Fangyuan Z 等[28]從青蒿中克隆DXS基因(AaDXS1、AaDXS2、AaDXS3)，發(fā)現(xiàn)AaDXS2在特定組織中的表達(dá)模式與青蒿素合成的表達(dá)模式相似，并推測AaDXS2是合成青蒿素途徑中的唯一一個DXS家族成員。據(jù)報道，DXS基因?qū)挂虏葺祁惓煞趾铣赏緩酱嬖谟绊?，Isabel[29]通過轉(zhuǎn)化寬葉薰衣草，將DXS基因與催化MEP途徑第2步的關(guān)鍵酶基因DXR(1-脫氧-D-木酮糖-5-磷酸還原酶)的功能進(jìn)行比較，證明了DXS基因?qū)祁惓煞趾铣赏緩降恼{(diào)控作用更為明顯；擬南芥DXS基因?qū)雽捜~薰衣草基因組后發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因植株葉片和花朵中精油產(chǎn)量比對照顯著提高[30]。

利用原核體外表達(dá)進(jìn)行基因功能的驗證具有操作簡單、周期短的優(yōu)點(diǎn)。馮國慶[31]對紫杉醇的TCDXS基因構(gòu)建了原核表達(dá)載體，并成功在Transetta (DE3)中表達(dá)。Wei Hui等[12]將PtDXS重組蛋白在大腸桿菌BL21(DE3)中表達(dá)純化后進(jìn)行活性評價，結(jié)果表明，純化后的蛋白能夠催化甘油醛-3-磷酸和丙酮酸形成1-脫氧-d-木酮糖-5-磷酸(DXP)。研究構(gòu)建了薰衣草DXS基因原核表達(dá)載體，并成功進(jìn)行了誘導(dǎo)，但是由于大腸桿菌的密碼子偏好性，外源基因DXS在Transetta中表達(dá)量不高，且容易降解。研究成功誘導(dǎo)得到含有組氨酸標(biāo)簽的DXS蛋白，為后期該蛋白的純化和復(fù)性打下基礎(chǔ)，也是構(gòu)建體外酶活體系鑒定雜花薰衣草DXS蛋白功能的前提。

4 結(jié) 論

DXS基因表達(dá)量與薰衣草精油產(chǎn)量存在正相關(guān)關(guān)系，薰衣草DXS基因可能是調(diào)控薰衣草萜類代謝物合成的限速酶；建立了DXS基因的原核表達(dá)系統(tǒng)。