亮斑扁角水虻形態觀察及誘產卵菌的篩選

荊海全，鐘 問，詹發強，楊 蓉，包慧芳，侯 敏，龍宣杞

(1．新疆大學生命科學與技術學院，烏魯木齊 830052；2. 新疆農業科學院微生物應用研究所，烏魯木齊 830091 )

0 引 言

【研究意義】亮斑扁角水虻(Hermetiaillucens, black soldier fly)是一種雙翅目(Diptera)、水虻科(sratiomyidae)亮斑扁角屬(Hermatia)的一種完全變態的營腐生性資源昆蟲[1]。亮斑扁角水虻免疫系統強大、抗逆性強、嗜群居、取食范圍廣泛、繁殖能力強、代謝快，是現階段食源性昆蟲研究的熱點。亮斑扁角水虻在不同環境發育歷程有所區別，新疆天氣干燥，晝夜溫差較大，了解亮斑扁角水虻各個生命階段的生活習性、生命歷期、及其對環境的適應性是新疆開發利用水虻的前提。提高水虻產卵量，是其在畜禽行業糞便、餐廚垃圾的利用與處理中規模化應用的基礎。在新疆進行亮斑扁角水虻的適應性研究能夠擴大亮斑扁角水虻的研究數據，對亮斑扁角水虻形態觀察及誘產卵苗的篩選，對亮斑扁角水虻在新疆的規模養殖與利用有重要意義。【前人研究進展】楊森[2]在中國海南熱帶季風氣候條件下，進行了連續人工飼養亮斑扁角水虻的探索，發現水虻在32 d左右可以完成由卵到成蟲的發育；Fernanda Rocha de Oliveira[3]對亮斑扁角水虻幼蟲及成蟲進行電子顯微觀察和形態學描述。鄭龍玉等[4]做了亮斑扁角卵攜帶微生物對成蟲產卵行為及幼蟲生長的影響，發現卵表細菌是卵誘成蟲產卵的主要因素。【本研究切入點】亮斑扁角水虻各階段發育歷期因其所處環境不同而不同，新疆氣候干燥，晝夜溫差大，有關亮斑扁角水虻在新疆的研究還未見報道。研究亮斑扁角水虻形態學、亮斑扁角水虻生態特征，如亮斑扁角水虻種群雌雄比例變化規律、亮斑扁角水虻交配行為進行細致描述，并對卵表誘產卵細菌進行分離和鑒定。【擬解決的關鍵問題】對亮斑扁角水虻在新疆進行4代養殖，比較不同培養基喂養下水虻的生活史，并對卵、幼蟲、預蛹、蛹、成蟲形態進行觀察和記錄，對其促產卵菌進行分離和鑒定。通過4代本地養殖，研究亮斑扁角水虻在新疆的生活習性、種群雌雄比例變化、交配產卵等規律，篩選誘產卵菌并鑒定，為亮斑扁角水虻在本地區的應用提供研究數據。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 供試蟲卵

亮斑扁角水虻蟲卵(武漢品系)，由華中農業大學生物工程實驗室提供。

1.1.2 設備及裝置

MSSPX- 250型生化培養箱，MLS -3020 高壓蒸汽滅菌鍋，SW-CJ-1F B型單人雙面凈化工作臺，恒溫搖床 HWY-100，Nikon Ni-生物成像顯微鏡、日立SU8010掃描電鏡、NY20CK-11充油式電暖器，空氣加濕器、植物組織光照燈、溫濕度計、塑料盆、藥品箱、孵卵架、瓦楞紙板(230×20) mm、全封閉蚊帳(1 200×2 000×1 700 )mm。

1.1.3 培養基及培養料

LB培養基配方：胰蛋白胨10 g，NaCl5 g，酵母膏10 g，瓊脂10 g，pH7.2、水1 L。

CB∶玉米粉∶麩皮∶水=1∶1∶1.2。

JCM：海棠果60 g，CB60 g，雞糞120 g。

1.2 方 法

1.2.1 試驗設計

2018年9月初，從華中農業大學生物工程實驗室引進亮斑扁角水虻卵，于溫度(26±1)℃，濕度60%±10%的條件下飼養至F2代；對F3代、F4代水虻幼蟲在室內進行馴化飼養；分別觀察記錄各飼養條件下亮斑扁角水虻卵、幼蟲、蛹、成蟲等不同階段的發育歷期、生活習性、成蟲種群雌雄比例，對不同期水虻顯微拍照；從亮斑扁角水虻卵中分離篩選誘產卵菌并做初步鑒定。

1.2.2 亮斑扁角水虻飼喂

1.2.2.1 亮斑扁角水虻卵的孵化

將玉米粉、麩皮、水按1∶1∶1.2的比例攪拌均勻，揉碎小塊，置于塑料盆中，將水虻卵放在孵卵架上并置于塑料盆上，蓋3層紗布，室內溫度保持在28℃左右，白天每隔4 h翻動1次培養料，以避免其發霉。

1.2.2.2 亮斑扁角水虻幼蟲的培養

待水虻幼蟲大量孵化出時，每日添加20 mm厚培養料，適度噴水，保持濕度60%左右和溫度26℃左右，待水虻生長1周后，用4 mm網孔篩使蟲糞分離，適時分盆調節種群密度，使水虻充分生長。

1.2.2.3 亮斑扁角水虻蛹的管理

待水虻開始進入預蛹期時，逐漸減少飼喂料，待水虻約一半化蛹時，停止飼喂，待約2/3水虻不動時，于水虻表面適量噴水；待水虻蛹開始羽化時，在塑料盆底部鋪5 cm尾料[5]，將水虻連盆放入蚊帳內，白天用植物組織光照燈光照9.5 h，夜間將燈關閉。

1.2.2.4 水虻成蟲管理及雌雄比例記錄

待水虻開始羽化2 d后，對水虻成蟲噴水300 mL/d，植物組織光照燈光照9.5 h/d；每天早上10∶00、中午15∶00、晚上20∶00隨機抓取水虻成蟲輕捏其尾部觀察其生殖器識別雌雄，參考“乒乓球記分法”記錄種群雌雄比例，即隨機抓取水虻成蟲，若為雄性記雄性1分，若為雌性記雌性1分，二者中有一方至11分停止記分，早、中、晚各記錄3次得分，記錄后放回。

1.2.2.5 亮斑扁角水虻的馴化

F3、F4代卵分別在28℃孵化，待幼蟲孵化出7 d后，適當調節水分，F3代于溫度(21±1)℃、濕度60%±10%，F4代于溫度(24±1)℃、濕度60%±10%條件下用培養F1代剩余的尾料培養水虻，每天觀察蟲子生長狀態，每2 d翻動培養料1次，每周換料1次，待觀察到首只水虻羽化時調節溫度于27±1℃停止馴化。

1.2.2.6 收卵板的制作

將瓦楞紙用小刀裁剪為長230 mm、寬20 mm的小方條，將5個小方條用皮筋在其兩邊捆扎，分別稱取1 g棉花塞在瓦楞紙板兩側內部，制成瓦楞紙板使用前在超凈工作臺內紫外滅菌30 min。

1.2.2.7 亮斑扁角水虻生活史

飼養亮斑扁角水虻11個月，用直接觀察法記錄亮斑扁角水虻卵孵化歷期、幼蟲成長史、成蟲交配產卵規律。

1.2.2.8 亮斑扁角水虻形態

先分別將實驗室自養的水虻卵、1日齡幼蟲、幼蟲、預蛹、蛹、成蟲用卡羅液固定24 h，然后改用75%酒精保存12 h，在顯微鏡下進行觀察，結合飼養過程對水虻形態特征進行描述。

1.2.2.9 水虻壽命與重量的關系

將剛孵化出的水虻成蟲分為雌蟲、雄蟲、雌雄各半3組各20只放在采樣袋里，放于植物組織光照燈下，每天統計各組水虻存活數量，記錄成蟲成活率并隨機抓取每組水虻成蟲稱重(n=5)，記錄后放回。

1.2.3 誘產卵菌的分離、篩選和鑒定

1.2.3.1 水虻卵攜帶微生物的分離純化

參考楊森等[6]的方法稍作改動。稱取亮斑扁角水虻新鮮卵簇0.05 g，用小鑷子取出后用無菌生理鹽水洗滌3遍，再轉至研缽中添加1 mL生理鹽水，研磨，然后將研磨液梯度稀釋，10-4、10-5、10-63個稀釋梯度各自吸取0.5 mL菌液涂布于LB平板(n=3)中30℃培養，24 h后挑取典型菌落進行純化培養，分離出典型菌落。

1.2.3.2 水虻腸道菌的分離純化

取孵化出4 d的水虻小幼蟲6只，饑餓處理24 h，在超凈工作臺內先將其浸入生理鹽水處理處理2 min，在將其浸入酒精1 min，接著用鑷子將其夾入3%次氯酸鈉中處理30 s，然后將其轉入新的生理鹽水中處理10 s，最后將其夾入研缽中，用刀片在幼蟲腹部背面輕輕劃開，用鑷子夾出腸道組織及內容物，加入1 mL生理鹽水研磨，將研磨液梯度稀釋，取10-4、10-5、10-6梯度液各0.5 mL涂布于LB平板(n=3)，30℃培養，24 h后提取典型菌落純化培養，并做標記。

1.2.3.3 發酵液的制作

將純培養F2代的典型菌落接種于含100 mL LB發酵液的250 mL三角瓶中，于160 r/min、30℃的恒溫搖床內培養24 h，然后將菌液繼續接種活化1次，于160 r/min、30℃的恒溫搖床內搖床培養48 h備用。

1.2.3.4 誘產卵菌的篩選

F3代、F4代水虻各處理1次。密閉蚊帳內放置600×450×500 (mm)的6個白色塑料箱，于每個塑料箱中放置1萬只亮斑扁角水虻蛹，且在其上放置1個塑料托盤。水虻開始大量羽化3 d后，在每個托盤中放置3個接有發酵菌液的瓦楞紙板，每天早上09:00接菌，晚上19:30半后收集蟲卵，稱量各處理組蟲卵量，與只接LB液體培養基的對照組對比蟲卵量，卵重高于對照組的處理菌液為有誘產卵效果組。

1.2.3.5 誘產卵菌的鑒定

將有誘產卵效果的菌進行革蘭氏染色、16s RNA鑒定，對獲取的序列在Eztaxon官網上查找相似菌株序列，用MEGA7.0構建系統發育樹。

2 結果與分析

2.1 水虻培養歷期

研究表明,各飼喂組孵化所需時間為2～4 d，這與楊森[2]報道的2～6 d結果基本一致，在常規孵化條件下亮斑扁角水虻在疆能夠正常孵化；馴化組開始蛻皮時間、一半化蛹時間、開始羽化時間明顯變長，分析是因為馴化環境溫度(21±1)℃相對偏低，水虻代謝活動相對變慢，而F4代馴化時間較F3代短，主要是因為初夏環境溫度變高且亮斑扁角水虻逐漸對環境適應的結果，另外用CB飼喂水虻，水虻從卵到成蟲開始羽化時間為41～42 d，這與郭鳳達[7]的38 d稍有延長，在適宜條件下人工飼養水虻，地理位置對水虻的生長發育的影響不大。而馴化組生命周期變長，且初春21℃及初夏24℃馴化條件下水虻生命期分別延長20和10 d，氣候環境主要是溫濕度對水虻生長發育影響較大。此外，抓飯及拌面餐廚余飼喂水虻，水虻歷期延長約2～4 d，而JCM飼喂水虻，水虻幼蟲共經歷7個多月才羽化，培養基類型對水虻生命歷期有重要影響。表1

表1 亮斑扁角水虻培養歷期(d)Table 1 Culturing Period of Hermetia illucens under different conditions

2.2 亮斑扁角水虻生活史

2.2.1 亮斑扁角水虻卵

雌性亮斑扁角水虻成蟲在其受孕2～3 d后開始產卵，單只產卵約300～600粒，Cuncheng Liu等[8]報道的雌性單只產卵量可達900只。剛產出的卵為白色，隔天變黃以卵簇的形式聚集在瓦楞紙空隙中；亮斑扁角水虻蟲卵容易因干燥失水死亡，宜在其母體產出1～2 d內孵化，另外，蟲卵本身為高蛋白營養體易受霉菌侵染。水虻卵在適宜溫度26～30℃陰暗環境下即可孵化，孵化歷期一般為2～4 d，孵化時將其置于距離培養基15 cm高的孵化架上孵化，幼蟲孵出后即落在培養基上生長。

2.2.2 亮斑扁角水虻幼蟲

剛孵化出的小幼蟲能夠爬動，比較活潑，但同時生命力較脆弱，容易因饑餓、培養基發霉、干燥等外因而致死，需要在養殖過程中及時添料、保持濕度，適當翻動培養基；水虻幼蟲柔軟，其頭部口器堅硬，具有較強的穿透能力，水虻幼蟲利用其頭部口器可以從腐生動物尸體及其糞便中刮取營養；亮斑扁角水虻幼蟲白色無足，靠蠕動向前爬行，另外，幼蟲復眼發育緩慢，厭光，因而蟲體一般位于基質中下部。而當其在饑餓狀態下時，水虻腹部背面變黑，可觀察到其腹部腸道黑色內容物，據此可作為添加新培養基的依據。另外，饑餓會使老熟幼蟲提前蛻皮，其原因可能為水虻在饑餓環境下提前進入休眠期以保護自身。亮斑扁角水虻幼蟲在適宜溫度、濕度、養料充足的條件下生長迅速，大多可長至0.14～0.2 g，部分可長至0.3～0.34 g，老熟幼蟲體重約為卵期的2 000～4 000倍。亮斑扁角水虻幼蟲期約20 d到數月不等，水虻幼蟲滯育的原因主要是陰暗、極度潮濕、純雞糞等逆境環境或富營養條件。亮斑扁角幼蟲在正常條件下共經歷2次蛻皮，第1次蛻皮后，其體表略帶淡黃色，自第2次蛻皮后，進入預蛹。

2.2.3 亮斑扁角水虻預蛹

亮斑扁角水虻進入預蛹期后，其體表變黑并逐步變硬，取食量也逐漸下降，與老熟幼蟲相比，其體重稍輕，對濕熱敏感，喜歡往相對干燥的環境爬動[9]。預蛹期共經歷5～8 d。

2.2.4 亮斑扁角水虻蛹

亮斑扁角水虻進入蛹期后停止活動，尾部翹起，體表明顯變硬達生命期最硬，內部體液為藍色漿狀稍帶香味，共經歷4至十幾天不等，大多歷期5～7 d。研究發現水虻蛹開始羽化后，適量噴水有助于蛹的進一步羽化，水虻羽化與其他昆蟲一樣對濕度有一定要求。[10]水虻羽化時，水虻成蟲將蛹殼前端頂破，但蛹殼與成蟲身體常常粘連，此時水虻成蟲不停爬動，最終憑借“求生能力”脫離蛹殼進入成蟲期。

2.2.5 亮斑扁角水虻成蟲

亮斑扁角水虻成蟲剛羽化出時，就具備天生的飛行能力，且性格相對暴躁，成蟲常常上下擺動其左右觸角棒以增加其對環境的了解；亮斑扁角水虻成蟲頭部上下點水用其吸盤飲水，一般不再取食、有訪花習性。水虻成蟲反應相對遲鈍，很容易被捕捉，但若多次捕捉失敗會提高其靈敏性；水虻成蟲羽化主要在其首只羽化后3～4 d后開始集中羽化，且在水虻開始羽化2 d后在植物光照燈下即進行交配；

2.2.6 水虻交配

亮斑扁角水虻交配對溫度有一定要求，24℃為臨界交配溫度，在24℃以下不交配，且交配主要在26～30℃進行。交配大多是在飛行的狀態下開始的，雄蟲在飛行中按雌蟲飛行軌跡追逐雌蟲與其抱團，然后一起落在地面、培養箱、蚊帳等支撐面上，接著雌蟲向前爬動，此階段雄蟲煽動左右翅膀(Giulia Giunti等發現雄蟲煽動翅膀對引起雌性水虻注意及交配許可尤為重要[11])，生殖器向下彎曲嘗試與雌蟲尾部對接，交配通常在幾秒到十幾秒完成尾部對接(也有可能對接失敗即交配失敗)，待二者尾部對接完成以后，雄蟲大多情況下會轉頭走下雌蟲背部與雌蟲進行交配，此后一般雌雄蟲不再爬動或一方通常為雌蟲爬動，另一方被其帶動爬動,且二者保持相對安靜，Giulia Giunti等[11]研究發現,此過程雌性基本不動，雄性以較低的頻率上下輕微擺動觸角棒。水虻交配大多以180°直線型、尾對尾、兩頭反向交配，少數以60～90°“V”字型進行交配，交配持續時間較長，可達40～80 min。另外水虻交配也可以以雄蟲飛到雌蟲背部與雌蟲交配，但這種交配方式持續時間短，效果差；水虻成蟲交配在光照的環境照下進行，在無光的情況下可以持續，但大多交配在有光照下進行。此外，水虻交配存在競爭行為，具體表現為5～6只水虻疊加抱成一團，且各雄蟲生殖器向下彎曲，但這種行為持續時間因負重短暫，是1種無效的交配方式。水虻并非只在雌雄之間空中抱團，也存在一部分雄雄抱團現象，分析可能是水虻雄蟲的競爭行為也可能是水虻雄蟲對水虻雌蟲識別力較差的緣故。

2.2.7 雌蟲產卵

水虻完成交配后約2～3 d后開始產卵，產卵一般在有孔或縫隙的紙板上進行，雌性水虻產卵時尾部露出生殖器2～4 mm伸進產卵孔隙內進行產卵，產卵期間相對安靜，但當正產卵水虻遇到其他水虻干擾時，產卵雌性水虻發出“嗡嗡”叫聲警告驅逐其他來犯水虻，亮斑扁角水虻雌蟲有此種表現可能是產卵水虻與其他雌性水虻競爭產卵地，雌性產卵水虻可在一個紙孔中連續幾十分鐘產卵，水虻有時也選擇在不同的空隙附近走動，均勻向孔隙中產卵。產卵通常在光照下進行，但在黑暗環境中產卵行為可以繼續保持，產卵早晚都可進行，雌性水虻產卵對產卵基質有一定的嗜好性，通常在有培養基質、有卵、有幼蟲的地方產卵。

2.2.8 成蟲死亡

亮斑扁角水虻成蟲飛行、交配等生命活動大量消耗了其體內貯存的脂肪，亮斑扁角水虻雄蟲在生命末期其腹胸部脂肪基本耗盡，蟲體體內水分大大減少，最后一般失去爬行能力，煽動翅膀直至死亡，新鮮蟲尸略帶香味。圖1

2.3 亮斑扁角水虻形態特征

研究表明,卵橢圓、表面光滑、白色至透明隔天變黃、近似米粒狀，由一層保護膜所包裹的實體；剛孵化出幼蟲11節，白色，頭部淡黃色，剛毛漸長；熟幼蟲剛毛較長，側板、背板剛毛清晰整齊，左右一致，隨日齡增加各節背毛變多，毛刺漸粗顏色也漸深，各節縫后短從毛漸少，短于側板毛。

亮斑扁角水虻蛹金黃至深褐光澤，節縫溝深而明顯，剛毛較短，蛹組織分布均勻、頭部有明顯刺突，觸角棒等各器官漸形成；另外亮斑扁角水虻復眼發育遲緩；

雄蟲頭部亮黑色，復眼寬分離，黑褐色，無毛，小眼面較小，大小一致。單眼瘤小，明顯，單眼黃褐色到紅褐色。后頭兩側近復眼頂角處有2個淺黃斑。上額中部和下額微凸，下額上部兩側各有一個淺黃色小圓斑，中部觸角上的位置有1對黃色縱條斑。顏部微凸，中下部向前下方延伸成1個圓錐形小鼻突，顏中部具1個淺黃色紡錘形縱斑，兩側沿復眼緣有黃褐色向下漸窄的縱條斑。頭部的淺黃斑有時為黃褐色或不明顯。頭部被白色直立短毛，頭頂、顏下部和頰毛較明顯。

觸角黑色，但梗節和第1～3鞭節紅褐色，第8鞭節長為其余鞭節總長的1.3倍；柄節和梗節被長黑毛，鞭節密被淺黃粉，觸角芒被短黑毛。

喙黑色，被長黃毛。須2節，黑色，極短小，被短黃毛。

翅長11～13 mm，翅脈清晰，左右翅膀基本對稱，后翅演化為平衡棒，平衡棒基部尖細，端部小葉狀、白色，左右翅重疊覆蓋于腹背板上部。

腹部長橢圓形，向端稍漸窄，長于胸部。腹部紅褐色，第1背板和第2背板側邊黑褐色，第1背板端緣兩側(除側邊緣外)和第2背板兩側(除側邊緣外)為白色稍透明，形成2個近方形白色透明斑；第1腹板端半部和第2腹板白色稍透明。

雄性外生殖器：第9背板長大于寬，心形，基緣具半圓形凹缺，端緣較尖；尾須長卵圓形；生殖基節長稍大于寬，基緣平，端緣中部具2個方形突，兩側各具一個端部鈍的扁側突；生殖基節突端部遠超過生殖基節基緣，超出部分長幾乎達生殖基節長的一半；生殖刺突與生殖基節強烈愈合，陷入生殖基節腹面端部，與其幾乎融為一體；生殖刺突端緣中部凸，內側具1個小乳頭狀突，頂端具一叢刷狀毛，外側具一較大的乳頭狀突；陽莖復合體明顯細長，三裂葉，三葉等長，向端漸細呈針狀，明顯分開。

雌蟲與雄蟲相似，僅觸角第1～3鞭節明顯膨大，雄蟲觸角第1～3鞭節不膨大。圖1

注：A、B為卵整體面觀； C、D、E、F分別為從卵孵化出1日、2日、15日、20日幼蟲面觀；G、H為老熟幼蟲頭部面觀；I為老熟幼蟲尾部面觀；J為蛹背面觀、K蛹腹面觀、L為蛹尾部面觀；M、N、O為蛹頭部面觀P、Q為成蟲頭部面觀；R、S為左右翅面觀；T為雄蟲腹部背面觀U為雄蟲腹部腹面觀V為雌蟲腹部背面觀、W為雌性生殖器面觀、X為雄性生殖器面觀A、B Holistic view of eggs; C 、D、E、F The Holistic view of larvae hatched from eggs on the 1st, 2nd fifteenth and tentieth day respectively;G 、H Holistic view of mature larvae head ;I Tail view of mature larvae;Jpupa back view;K Holistic view of Pupa abdomen L The appearance of pupa tail;M、N、O Electronic Scanning of Pupae Head;P、QHolistic view of Adult head;R、S Wing View;T The back view of male adult;U Abdominal aspect of male adult;V Abdominal appearance of female adult W Female genital aspect,X Male genital aspect圖1 亮斑扁角水虻形態觀察結果Fig.1 Morphological Observation of Hermetia illucens

2.4 水虻成蟲群雌雄比例、成蟲重量變化規律

研究表明，水虻開始羽化2 d內雄蟲占絕對優勢，但雌性水虻成蟲數量逐漸迅猛增多，到第4 d時雌蟲數量與雄蟲數量相當且雌性成蟲以此比例保持2 d，到第5 d時水虻成蟲雌性與雄性水虻在量上進入“可競爭期”；到第6 d時雌性水虻數量總體超過雄性水虻，其后每天早中晚9次統計中雌性比例總體“占上風”，在第17 d時，雄性水虻比例處于劣勢，到21 d時水虻群主要以雌性為主，此時水虻群整體處于末期。圖2

圖2 亮斑角水虻成蟲群雌雄比例變化Fig.2 Change of male-female ratio of adult population of Hermetia illucens

研究表明,亮斑扁角雌蟲水虻重量略高于雄蟲,亮斑扁角水虻雌雄蟲重量隨著羽化后天數的變化而逐漸下降，且水虻成蟲前期體重下降較快，后4 d體重下降趨緩，因為水虻成蟲前期以飛行為主的活動耗能較多，其體重下降稍快；亮斑扁角水虻雌蟲重量高于雄蟲且基本貫穿成蟲生命期；亮斑扁角水虻成蟲壽命在試驗條件下約為7～9 d，低于周芬等[12]報道的13～14 d，但與Chelsea D. Miranda等[13]報道的8 d接近。圖3

圖3 亮斑扁角水虻成蟲重量變化Fig.3 Weight Changes of Adult Hermetia illucens

2.5 亮斑扁角水虻誘產卵菌篩選

研究表明,e1和Y3 2菌發酵液對亮斑扁角水虻產卵有較好的引誘效果，其產卵量明顯高于對照組，e1和Y3 2菌液誘產卵量分別為對照組的6.26和7.40倍，具有明顯的誘產卵效果。 表2

表2 不同發酵菌液誘導亮斑扁角水虻產卵量Table 2 Statistical Table of oviposition induced by different fermentation bacteria

2.6 亮斑扁角水虻誘產卵菌鑒定

研究表明,e1及Y3 為2種菌皆為革蘭氏陽性菌，系統發育樹結果，初步鑒定e1為暹羅芽孢稈菌、Y3為新微球菌屬，且Y3為1種潛在的新菌。表3，圖4～6

表3 亮斑扁角水虻誘產卵菌的革蘭氏染色結果Table 3 Gram staining results of oviposition-inducing bacteria of Tadpole Leptospira

注：Y、Z分別為e1、Y3革蘭氏染色結果，AA、AB分別為e1、Y3菌落形態Note：Y, Z , as e1,Y3 Gram staining respectively, AA,AB as e1,Y3 colony morphology respectively圖4 誘產卵菌革蘭氏染色結果及形態Fig.4 The results of Gram staining and colony morphology of oviposition-inducing bacteria

注：標尺表示遺傳距離Note：Scale bar indicates the genetic distance圖5 鄰接法分析菌株e1系統發育樹Fig.5 Phylogenetic tree of strains e1 based on 16 SRNA constructed by Neighbor-joing method

注：標尺表示遺傳距離Note：Scale bar indicates the genetic distance圖6 鄰接法分析菌株Y3系統發育樹Fig.6 Phylogenetic tree of strains Y3 based on 16 SRNA constructed by Neighbor-joing method

3 討 論

亮斑扁角水虻憑借其強大的生命力和適應性在世界范圍內廣泛分布，我國海南、廣西、廣東、湖北、江蘇、山東、遼寧、河北、四川、云南、貴州、陜西、臺灣、香港等省份和地區都有分布[14]，并且其正處于產業化發展的初期，發展勢頭迅猛，前景廣闊，在新疆等西北地區開展亮斑扁角水虻的研究對于綜合了解水虻適應性從而更好在該地區開發利用水虻具有積極意義。

在新疆室內條件下養殖亮斑扁角水虻11個月。經過長期觀察，對亮斑扁角水虻卵、幼蟲、蛹、成蟲各階段生活習性、形態特征、交配方式、產卵規律做了詳細記錄和描述。有關亮斑扁角水虻的交配行為、形態特征較前人報道也更為詳盡；亮斑扁角水虻6×104只成蟲群在實驗條件下約保持24 d，說明成蟲群產卵期較長，另外其每天產卵數百孔，亮斑扁角水虻可在該地區世代規模養殖。

對亮斑扁角水虻誘產卵菌進行了分離篩選，共篩到2株可明顯誘產卵的菌株e1和Y3，其中e1初步鑒定為暹羅芽孢桿菌，其與Bacillusvelezensis(貝萊斯芽孢桿菌)及Bacillusamyloliquefaciens(解淀粉芽孢桿菌)進化關系較近，而楊森等[6]報道的誘產卵菌EEAM-10B及EEAM-3都與解淀粉芽孢桿菌進化關系較接近；Y3對亮斑扁角水虻誘產卵效果較好，初步鑒定為節桿菌屬，而此菌在前人的研究中未見報道，亮斑扁角水虻誘產卵菌并不局限于少數幾種菌，為一種潛在的新菌。

4 結 論

亮斑扁角水虻從卵到幼蟲孵化歷期與其培養基類型、溫度等因素有關，亮斑扁角水虻在新疆馴化周期有所延長，但其發育完好，能夠在該地區進行世代飼養，具有規模生產和開發利用潛力；觀察并記錄了其卵、幼蟲、蛹、成蟲及其其生殖器形態；篩選到對亮斑扁角水虻雌性成蟲有誘導產卵效果的2株菌e1、Y3，其發酵液處理組平均產卵量分別為對照組的6.26和7.40倍，2株菌皆為革蘭氏陽性菌，經16S RNA測序、Eztaxon查找相似序列菌，MEGA7.0構建系統發育樹，鑒定e1為暹羅芽孢桿菌，Y3為節桿菌屬，且Y3為一種潛在的新菌。