PTEN/PI3K/AKT通路緩解糖尿病視網膜病變的機制

楊麗娜 方肖云

(浙江大學醫學院附屬第二醫院，浙江 杭州 312500)

糖尿病視網膜病變是糖尿病最為嚴重、常見且對視力功能有嚴重影響的眼部并發癥，是糖尿病患者致盲的主要原因之一〔1〕。視網膜病變后視神經元凋亡是導致患者視功能不佳甚至失明的主要原因，故找到一種抑制視網膜病變后光感受器細胞凋亡的方法，對改善糖尿病視網膜病變患者的視功能及降低失明風險意義重大〔2，3〕。研究發現，發育期的視網膜節細胞中有第10號染色體缺失的磷酸酶和張力蛋白同源物基因(PTEN)優先定位〔4〕。PTEN參與神經元凋亡的過程，作為一種主要的神經元凋亡調節因素，PTEN具有蛋白磷酸酶與脂質磷酸酶雙重活性，作為脂質磷酸酶時，可對磷脂酰肌醇-3-激酶(PI3K)/絲氨酸蘇氨酸蛋白激酶(AKT)信號通路產生負性調控，抑制細胞生長，加速細胞凋亡〔5〕。Sun等〔6〕研究發現，將成年小鼠視網膜上PTEN基因敲除后，視神經損傷，但視網膜神經元活性增加，認為PTEN的失活是提高皮質神經元再生能力的主要原因。故推測抑制PTEN影響PI3K/AKT信號通路可能對緩解糖尿病視網膜病變有一定價值，但目前與之相關的研究并不多見。本研究探討PTEN/PI3K/AKT信號通路緩解糖尿病視網膜病變的機制。

1 材料與方法

1.1實驗動物 購自甘肅中醫藥大學科研實驗動物中心的50只SD大鼠，許可證號：SCXK(甘)2019-0001。大鼠周齡均為8 w，雌性25只，雄性25只，雌性與雄性分籠喂養；體重0.20～0.22〔平均(0.21±0.01)〕kg。

1.2主要實驗設備與試劑 北京博愛科貿生物有限公司提供的鏈脲佐菌素、上海派普泰克生物制劑有限公司提供的內皮生長因子、美國Sigma公司提供的雙過氧釩(bpV，PTEN特異性抑制劑)、美國Roche公司提供的TUNEL原位細胞凋亡檢測試劑盒、上海華靈康復器械廠提供的高效切片石蠟、上海化學試劑公司提供的各類化學試劑，如多聚甲醛、二甲苯等、日本Olympus公司提供的熒光顯微鏡、光學顯微鏡，美國Cell Signaling公司提供的兔抗大鼠AKT單克隆抗體、p-AKT單克隆抗體，美國Abcam公司提供的兔抗大鼠B細胞淋巴瘤(Bcl)-2多克隆抗體、胞質細胞色素(Cyt)C多克隆抗體、磷脂酰肌醇-3,4,5-三磷酸(PIP3)依賴性激酶(p-PDK)1多克隆抗體、鼠抗人半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶(Caspase)-3單克隆抗體及胞質蛋白制備試劑盒，其他細胞裂解液、蛋白濃度檢測試劑盒等均由碧云天生物試劑提供。

1.3方法

1.3.1分組方法 SD大鼠50只，隨機抽取10只作為空白對照組，其余40只作為模型組建立糖尿病視網膜病變模型，視網膜病變大鼠模型均為增殖期。建模后隨機抽取10只大鼠納入安慰劑組，為其視網膜下注射安慰劑，其他30只大鼠視網膜下注射bpV隨機分為3組，bpV使用劑量分別為40 ng/kg、400 ng/kg、4 000 ng/kg。每組10只大鼠，動物的使用均符合視覺與眼科研究協會2014年年會提出的有關實驗動物使用的相關條款〔7〕。全部大鼠在12 h白晝/12 h夜晚的環境下喂養，環境濕度55%～60%，溫度：22～25℃。

1.3.2糖尿病視網膜病變建模方法 大鼠適應性喂養7 d后，模型組腹腔內注射60 mg/kg鏈脲佐菌素液，注射前禁食16 h，不禁水，注射3 d后檢測空腹血糖值，若≥16.7 mmol/L則判定為糖尿病；在成功建立糖尿病模型后，使用微量進樣器抽取內皮生長因子0.05 μg，于大鼠顳側角膜后緣2 mm水平處經睫狀體平坦部位向玻璃體腔內注射，進樣器緩慢推進并留針10 s，28 d后分批對模型組進行眼底熒光造影檢查，若造影結果顯示血管擴張迂曲、背景熒光增強、新生血管熒光滲漏等影像學表現則視作發生糖尿病視網膜病變，且病變階段為增殖期，成功建立糖尿病視網膜病變大鼠模型。

1.3.3模型組分組與給藥方法 全部建模成功的40只大鼠中隨機抽取10只納入安慰劑組，在成功建模第4天為其視網膜注射安慰劑，其他30只大鼠均在視網膜下注射bpV，隨機分為3組，劑量分別為40 ng/kg、400 ng/kg、4 000 ng/kg。

1.4相關指標的檢測

1.4.1制備組織切片 模型制作后3 d，使用1%戊巴比妥鈉向大鼠腹腔注射，處死大鼠，大鼠的處理符合中華人民共和國科學技術部“關于善待實驗動物指導性意見”中的相關意見〔8〕。大鼠處死后在角膜12點位置處做好標記，并保留角膜緣球結膜，將其他部位球結膜去除，摘取眼球后放置在眼球固定液中，行脫水、包埋、視神經矢狀切片等處理，切片厚度約為5 μm，用于免疫熒光染色操作。將分離得到的視網膜置于液氮內保存，進行Western印跡檢測。標本進行脫水、透明、浸蠟、包埋等操作。

1.4.2主要檢測指標與方法 結合免疫熒光與Western印跡法檢測PTEN在建模后1 d、2 d、3 d、7 d的表達，同時使用熒光凋亡試劑盒檢測視神經細胞元凋亡情況，嚴格按照試劑盒進行操作與判別。①免疫熒光檢測p-AKT、p-BAD、Bcl-2：大鼠雙眼球摘取后石蠟切片常規脫蠟，切片微波抗原修復，緩沖液沖洗，山羊血清內封閉，緩沖液沖洗，稀釋孵育過夜，緩沖液沖洗孵育后過夜，復染后再次沖洗，脫水操作后進行透明、封片，在熒光顯微鏡下觀察復染結果。②Western印跡檢測視網膜p-PDK1、CytC、Caspase-3蛋白水平：配制組織裂解液、緩沖液，提取組織總蛋白，分離線粒體與胞質，配制所需液體后進行各項操作，使用軟件檢測Western條帶灰度值，計算各蛋白內參β-actin灰度比值。③胞質處理后，采用酶聯免疫吸附試驗測定PIP3表達。

1.5統計學分析 采用SPSS20.0軟件進行單因素方差分析檢驗、SNK-q檢驗。

2 結 果

2.1大鼠建模后各時點PTEN表達水平 空白對照組大鼠PTEN表達水平為0.39±0.02，模型組建模后PTEN表達逐漸上調，建模后1、2 d分別為0.69±0.10，0.81±0.12，在建模后3 d達到峰值，為0.92±0.04，后呈下降趨勢，并在7 d(0.44±0.04)恢復至正常(F=232.456，P<0.001)。

2.2視神經元凋亡情況 空白對照組未檢出視神經元凋亡。建模后第1天，在模型大鼠外核層(ONL)發現少量凋亡細胞；第2天、第3天模型組大鼠ONL可見視神經元凋亡增加，表達強度增強；在建模成功第4天給予大鼠視網膜bpV注射，建模第7天即bpV注射3 d，此時可見有視神經元凋亡數量減少，表達強度明顯降低，見圖1。

圖1 各組視神經元凋亡情況(TUNEL，×100)

2.3各組p-AKT、p-BAD、Bcl-2、p-PDK1、CytC、Caspase-3表達比較 與空白對照組比較，安慰劑組、p-AKT、p-BAD、Bcl-2、p-PDK1、CytC及Caspase-3均明顯降低(P<0.05)。與安慰劑組比較，bpV組p-AKT、p-PDK1、p-BAD、Bcl-2表達顯著升高，胞質CytC、Caspase-3表達顯著上調，且bpV 4 000 ng/kg組>bpV 400 ng/kg組>bpV 40 ng/kg組(P<0.05)。見表1。

表1 各組p-AKT、p-BAD、Bcl-2、p-PDK1、CytC、Caspase-3相對表達檢測結果比較

3 討 論

糖尿病視網膜病變的發生與發展是一個極為復雜的病理過程，引起這種病變發生的病理原因涉及信號傳導代謝酶、細胞因子、炎癥反應、離子通道等諸多基因異常改變〔9〕。新生血管形成是糖尿病視網膜病變進入增殖期的主要病理特征，故阻斷新生血管的形成是目前糖尿病視網膜病變治療的主要研究靶點〔10〕。

PI3K/AKT信號通路在細胞中廣泛存在，主要作用是通過參與細胞的增殖、生長與分化調節來實現，該信號通路在激活的狀態下可加速內皮細胞存活周期，同血管內皮生長因子相互作用，介導細胞的遷移、存活、誘導新生血管形成，是一種促存活信號通路〔11〕。AKT是絲氨酸抗凋亡主要信號，可以通過調節內皮細胞的細胞周期來介導細胞周期相關蛋白水解并幫助其在細胞內定位，達到干擾G1期向S期過渡的目的，發揮調節內皮細胞遷移、增殖及血管新生誘導之效〔12〕。而PI3K被激活后，則主要受其第二信使PIP3刺激，產生下游更多信號分子，增強信號通路傳導，進一步增強PI3K通路在內皮細胞增殖、遷移、血管生成等病理改變中的作用〔13〕。周賽君等〔14〕研究結果發現，因高糖導致的缺氧缺血環境會激活內皮細胞內PI3K/AKT信號通路中AKT表達，增加其磷酸化，進而加速新生血管的形成。這種PI3K/AKT信號通路傳導信號增強的機制，被認為可用于指導糖尿病視網膜病變的治療〔15〕。神經元凋亡是諸多神經疾病包括視網膜病變在內的最終結局，可見抑制視神經元凋亡對緩解糖尿病視網膜病變患者病情與抑制病情進一步發展的關鍵意義〔16〕。PTEN是一個高度保守基因，在人與諸多哺乳動物中，其具有高度的同源性，可見PTEN在細胞生命中的關鍵作用〔17〕；PTEN作為一種脂質磷酸酶，可對PI3K/AKT信號通路產生負性調控，這種負性調控對細胞的生長有抑制作用，參與細胞凋亡〔18〕。

本研究結果提示PTEN表達增加可能介導了糖尿病視網膜病變大鼠視神經細胞的凋亡，可能是視網膜病變大鼠視功能逐漸減退的原因。故考慮抑制PTEN表達，可能對減輕視神經細胞凋亡、緩解疾病進一步進展有積極意義。結果表明抑制PTEN通路對阻礙糖尿病視網膜病變視神經元細胞凋亡有一定應用價值。糖尿病視網膜病變后抑制PTEN能夠重新對PI3K/AKT信號通路活性產生直接激活的效果，增加p-BAD、Bcl-2等表達，發揮理想的視神經保護之效。