天然藥物提取分離過程中凍融環節的控制

135000吉林天成制藥有限公司 吉林通化

凍融即冷凍-融解，是一種比較常用的提取方法。是在-20℃以下冷凍，室溫或恒定溫度下緩慢融化的一種方法，是一種比較溫和的破壁方式，可以避免高溫對原料所造成的營養損失等不良影響，也是使細胞破裂較為徹底的方法。目前凍融法多應用于天然藥物的提取，如李敏康[1]采用凍融法提取豬血纖維蛋白原，確定了提取工藝條件；崔素萍等[2]為了提高大米蛋白質的提取率，研究采用凍融及低頻超聲波處理大米漿體后，再用堿液法提取大米中的蛋白質，大米蛋白質的提取率可達92.6%；郭衛蕓等[3]通過反復凍融法破壁啤酒廢酵母的研究確定，當反復凍融次數為3次時，破壁率高，可溶性蛋白溶出率較高。不同提取劑和提取方法獲得的柿多糖在抗氧化和抗菌方面表現出較大差異，說明提取的過程與其生物學效能密切相關[4]；溫梓辰等[5]通過探究反復凍融法對枸杞多糖溶出率的影響，通過單因素試驗和正交試驗，驗證反復凍融法對枸杞多糖的提取效果，反復凍融法提取枸杞多糖的最佳工藝組合為：解凍溫度45℃，凍融次數4次，凍結時間3 h，凍結溫度-28℃；魏文志等[6]研究發現可以凍融輔助超聲波法提取小球藻多糖物質，回收率高。以上可以看到目前很多動植物的提取涉及凍融環節，且大多數提取物質為蛋白、多糖類，這類處理往往具有復雜的生產工藝環節，在整個工藝環節中大多使用1次或多次的凍融環節，以確保有效成分能夠有效地提取及雜質能夠徹底地分離，凍融的方式有多種，也有不同的凍融周期，往往在凍融的過程中會因冷凍時間、溫度及解凍時間、溫度的不同的對產品的質量產生巨大的影響，特別是解凍方式的選擇，由于提取液體積大，解凍時間長，部分部位或物質可能會發生變質，因此解凍方式也是凍融能否成功的關鍵步驟。本文通過實例對幾種解凍方式的對比分析，確定何種方式能夠效率最高，并且滿足生產需求。

應用實例

兔肌肉富含多肽、嘌呤等物質，通過反復凍融提取試驗，可以將有效成分分離，其質量直接影響制劑的質量。多組分生化藥品是一類特殊時期產生的特殊藥品，目前雖然爭議較大但是仍有很多此類產品被證明擁有很好的療效，具有針對性強、毒性低、不良反應小以及易被人體吸收等特點。生化藥品是從生物體分離、純化所得，來源于動物體，包括氨基酸及衍生物、多糖、酶及輔酶、脂類、多肽于蛋白、核苷酸及衍生物、多組分提取物。為保證藥品的有效性和安全性，這類藥品更需要關注過程控制，保證過程中產品質量得到最嚴格的控制。本文主要研究兔肌肉提取物多個凍融環節為研究對象，確定每個環節的最佳凍融方式。

表1 凍融①不同緩化方式情況對比分析

表2 凍融②不同緩化方式情況對比分析

表3 凍融③④不同緩化方式情況對比分析

試驗設計：⑴兔肌肉提取工藝簡述：白條兔→凍融①→剔出有效成分→冷凍→凍融②→一次勻漿→冷凍→凍融③→二次勻漿→冷凍→凍融④→提取→冷凍→凍融⑤→一次超濾→冷凍→凍融⑥→二次超濾。以上可以看到兔肌肉的提取過程中需要6次的凍融環節。這些環節的控制會影響到藥品質量的好壞。⑵批量：取白條兔300 kg，剔出有效部位后開始進行后續凍融研究工作。以上可以看到每批產品使用到原材料用量較大，凍融工作量復雜。⑶凍融標準：確保凍融徹底且無肌肉組織腐敗氣味產生。兔肌肉含有很多蛋白，多肽，氨基酸等營養物質，容易腐敗，提取工藝需要保證產品質量。⑷“凍融①”方法的選擇：此步驟需要將冷凍的白條兔緩化后將有效部分剔出轉入下道工序。目前我們有3種緩化方式：①自然緩化方式：常溫放于緩化盤內，隔夜緩化。②水浴緩化方式(浸泡緩化)：白條兔放于純化水中，隔夜緩化。③常溫循環泵緩化方式(流動水緩化)：生產當日放入循環緩化槽內緩化。⑸“凍融②”方法的選擇：此步驟需要將冷凍的兔肉緩化后進行勻漿操作。①自然緩化方式：常溫放于緩化盤內，隔夜緩化后開始勻漿。②常溫水浴緩化方式：白條兔放于純化水中，隔夜緩化后開始勻漿。③常溫循環泵緩化方式：生產當日放入循環緩化槽內，緩化后開始勻漿。⑹凍融③④方法的選擇：此兩步驟的緩化均屬于勻漿液緩化，內部物質相同，因此可選擇一種緩化方式。①自然緩化方式：隔夜取出后進行二次勻漿或提取。②常溫水浴緩化方式：隔夜取出后進行二次勻漿或提取。③恒溫循環泵水浴緩化方式：隔夜取出后進行二次勻漿或提取。⑺凍融⑤⑥：此兩個步驟的緩化均屬于超濾前藥液的緩化，緩化方式相同。①自然緩化方式：隔夜取出后進行超濾。②常溫水浴緩化方式：隔夜取出后進行超濾。③恒溫循環泵水浴緩化方式：隔夜取出后進行超濾。

結果與分析：凍融①方式的不同對質量的影響：凍融①解凍的是整只白條兔，由于緩化方式不同導致工藝用時，緩化結果也不同，雖然兔肌肉僅從外觀性狀上觀察，但是緩化時間過長容易導致白條兔表面發生變化，容易導致在緩化過程中表面的微生物繁殖，產生不良影響，因此本步驟采用循環緩化槽緩化較理想。見表1。

凍融②方式的不同對質量的影響：此步驟中凍融的是從有效部位剔除的兔肌肉，由于兔肌肉長時間和空氣或純化水接觸，容易滋生微生物，因此關鍵在于降低接觸時間，快速達到緩化的目的。常溫循環泵緩化既能夠保證低溫又能夠保證快速緩化，是最為有效的一種緩化方式。見表2。

凍融③④方式的不同對質量的影響：兔肌肉提取物屬于肌肉組織，是勻漿液，里面富含多肽、氨基酸等有機物質，極易在長時間常溫的過程中造成微生物繁殖，而在提取物過程中，凍融徹底與否直接影響著本批次的含量情況。所以選擇一種合適的緩化方式既能夠保證含量又能夠保證質量，綜合恒溫循環泵水浴緩化(18℃)方式較為合理。見表3。

凍融⑤⑥方式的不同對質量的影響：此步驟由于提取后藥液密度較小，因此緩化速度較前幾步稍快，但緩化方式的選擇同樣影響著緩化的效果。最終選擇低溫的方式能夠將藥液緩化徹底，進一步保證了藥液的低溫狀態，能夠保證產品質量。見表4。

結果與討論

本文以兔肌肉提取物生產過程中的各個緩化環節為例，經過對比的方式進行各種緩化方式的選擇，其目的就是為了最大限度的降低在緩化過程中所產生的微生物污染的風險，進一步保證產品的質量。可以看到在融化過程中我們使用了緩化槽，緩化槽是這樣的一種裝置它可以自動控溫，通過采用夾層保溫及頂蓋保溫的方式有效減少了環境溫度導致的槽內溫度升高。緩化過程中，緩化槽內加入潛水泵，這種潛水泵可以加快槽內水的流動，使整個緩化槽保持溫度均勻一致。同時在控制的時候，我們采用水位固定、裝載方式固定、加熱方式固定、時間固定的方式有效保證了產品的批次間的一致性。同時我們設計了合適的裝載容器，增大了緩化面積，縮短了緩化時長，更有利于緩化的均勻性。合適的容器，合適的溫度時長，既讓有效成分充分提取分離又控制了微生物的滋生，和降壓物質的產生，使產品符合質量控制的要求。

表4 凍融⑤⑥不同緩化方式情況對比分析

本文以兔肌肉提取為例，找出天然藥物提取分離過程中凍融環節最佳控制方式。本文所使用的恒溫循環泵水浴法大大降低了緩化過程中的時間并增強了緩化的效果，可以有效防止由于局部溫度升高引起的質量不合格問題，為指導天然藥物提取分離過程中的凍融環節控制提供依據。