基于網絡藥理學研究薄荷活性成分治療慢性膽囊炎的作用機制

孔麗　左華江　吳春鳳

【摘 要】 目的：基于網絡藥理學方法探究薄荷活性成分治療慢性膽囊炎的分子作用機制。方法：通過TCMSP數據庫及文獻挖掘篩選薄荷活性成分及其作用靶點，利用Genecards數據庫獲取慢性膽囊炎相關靶點，將慢性膽囊炎相關靶點與薄荷活性成分相關靶點進行匹配得到潛在治療靶點。構建薄荷活性成分-潛在治療靶點網絡圖、蛋白互作網絡圖，運用Metascape數據庫對潛在治療靶點進行生物學過程及信號通路分析，利用DisGeNET數據庫對靶點所屬的類型進行歸屬。結果：篩選得到薄荷15個活性成分，涉及40個潛在治療靶點，主要參與對類固醇激素的反應、對酸性化學物質的反應、上皮細胞增殖等生物過程，共涉及13條信號通路。結論：薄荷活性活性成分可能通過調控EGFR、MYC、CASP3、CCND1、VEGFA、ERBB2、MDM2、ESR1、IL6、PPARG等靶點以及Pathways in cancer、prostate cancer、AGE-RAGE signaling pathway in diabetic complications、PI3K-Akt signaling pathway等多個信號通路發揮薄荷活性成分治療慢性膽囊炎的作用。

【關鍵詞】 薄荷;慢性膽囊炎;網絡藥理學

【中圖分類號】R285.6 【文獻標志碼】 A【文章編號】1007-8517（2020）8-0027-07

Study on the Mechanism of Active Ingredients of Peppermint in the Treatment of Chronic Cholecystitis Based on Network pharmacology

KONG Li1，2 ZUO Huajiang2 WU Chunfeng1*

1.Liuzhou peoples Hospital Affiliated to Guangxi Medical University，Liuzhou 545006，China;2.Guangxi University of science and technology，Liuzhou 545006

Abstract：Objective To explore the molecular mechanism of active components of peppermint in the treatment of chronic cholecystitis based on network pharmacological methods.Methods TMTSP database and literature mining were used to screen mint active ingredients and their targets，Genecards database was used to obtain chronic cholecystitis related targets，and chronic cholecystitis related targets were matched with peppermint active component related targets to obtain potential therapeutic targets.Construct a mint active ingredient-potential? therapeutic targetsnetwork diagram and protein interaction network diagram，use Metascape database to analyze the biological process and signal pathway of potential therapeutic targets，and use the DisGeNET database to assign the types of targets.Results 15 active ingredients of peppermint were screened out，which involved 40 potential therapeutic targets.They were mainly involved in biological processes such as the response to steroid hormones，the response to acidic chemicals，and the proliferation of epithelial cells，involving 13 signal pathways.Conclusion The active ingredients of peppermint may regulate EGFR，MYC，CASP3，CCND1，VEGFA，ERBB2，MDM2，ESR1，IL6，PPARG and other targets，as well as Pathways in cancer，prostate cancer，AGE-RAGE signaling pathway in diabetic complications，PI3K- Multiple signaling pathways such as Akt signaling pathway play the role of mint active ingredients in the treatment of chronic cholecystitis.

Key words：Mint;Chronic Cholecystitis;Network Pharmacology

慢性膽囊炎是一種膽囊慢性炎癥病變[1]，屬于慢性炎癥性疾病，臨床表現為反復右上腹疼痛或不適、 腹脹、噯氣、厭油膩[2-3]。女性患病率高于男性[3]，且中老年群體為高發群體[1]。慢性膽囊炎屬中醫“膽脹”范疇，以右脅脹痛為主，針對該病的治療，近年來采用中醫治療，取得了較好的療效。

薄荷作為唇形科薄荷屬植物[4]，具有抗病毒、興奮中樞、抗菌[5]、保肝利膽、抑菌、抗氧化、抗炎[6]等藥理作用，在《藥性論》等多部古代醫藥典籍中，薄荷均被記載具有發汗解表作用，可用于溫病的治療。薄荷的主要成分包括揮發油、黃酮類等。揮發油中主要成分為左旋薄荷醇，其含量高達62%～87%[4，7，8]，左旋薄荷酮等。研究表明，薄荷醇和薄荷酮有明顯的利膽作用，其中薄荷醇在膽道的主要代謝產物中起了利膽的作用[4-5]。薄荷中的黃酮類成分中最主要的成分為蒙花苷，具有良好的抗菌作用[7]。雖然薄荷中的揮發油成分據報道已有治療慢性膽囊炎的作用[5]，但其活性成分及其相關作用機制尚不清楚。因此，研究薄荷中活性成分、作用靶點及其可能的作用機制，為進一步揭示薄荷治療慢性膽囊炎具有重要意義。

傳統的藥理學研究大多是基于“單因素觀察”，即證明藥物的某一方面的作用，需要通過對照試驗、施加單一因素作用，以揭示藥物對于疾病的作用機制[9]，而中藥具有多成分、多途徑、多靶點協同作用的特點[10]，因而傳統藥理學的研究方法與中藥的研究理念相悖。而網絡藥理學是系統生物學、網絡生物學等多種學科技術發展結合的結果，其以藥物、靶點以及疾病之間的網絡關系作為基礎，通過網絡分析手段，從整體性的角度出發，研究中藥的特征，觀察藥物對疾病的影響，將網絡藥理學應用到中藥中能夠提升中藥研究的現代化水平[11]。程曉平等[12]采用網絡藥理學方法探討了獨活治療骨關節的作用機制;李剛等[13]采用網絡藥理學方法對淫羊藿抗骨質疏松的分子機制進行了分析;王韌等[14]采用網絡藥理學方法從分子角度分析魚腥草治療支氣管炎的作用機制。因此本文基于網絡藥理學的方法對薄荷中的活性成分治療慢性膽囊炎的作用機制進行探討，可以提高其治療效果，臨床試驗的成功率以及降低其毒副作用。

1 材料和方法

1.1 薄荷中活性成分的篩選 通過中藥系統藥理學數據庫（TCMSP）（http：//tcmspw.com/），檢索薄荷的化學成分，并根據口服生物利用度（OB）≥30%、類藥性（DL）≥0.18、化合物含量以及明確的生物活性報道，篩選出薄荷中可能有效的活性成分。

1.2 潛在治療靶點的預測 通過TCMSP數據庫檢索上述薄荷相關活性成分的靶點，將其導入Uniprot（https：//www.uniprot.org/）數據庫，并限定物種為人類，將檢索得到的所有靶點校正為該靶點的基因名稱，用于后續其它工作的分析。通過GeneCards（https：//www.genecards.org/）數據庫，以“gallbladder”、“Chronic cholecystitis”為檢索關鍵詞，搜索慢性膽囊炎相關靶點，將其與上述所得薄荷活性成分靶點進行匹配，得到交集靶點，即為薄荷活性成分治療慢性膽囊炎的潛在治療靶點。

1.3 活性成分-作用靶點網絡構建與分析 將薄荷活性成分與潛在治療靶點導入Cytoscape Version3.7.0軟件，構建薄荷活性成分-潛在治療靶點網絡圖。

1.4 蛋白互作網絡的構建 將潛在治療點導入String（https：//string-db.org/）數據庫，限定物種為人，設置最低相互作用閾值為0.4，獲取蛋白相互作用關系，結果以TSV格式保存，保留node1、noe2、Combined score信息，將這三個信息導入Cytoscape軟件繪制蛋白相互作用網絡圖，并對網絡進行分析，保存分析結果，將節點大小和顏色設置用于反映Degree的大小，邊的粗細用于反映Combined score的大小，獲取最終的蛋白相互作用網絡圖。本研究基于以下參數：平均最短路徑（Average Shortest Path Length）、介數中心性（Betweenness Centrality）、中心接近度（Closeness Centrality）、聚類系數（Clustering Coefficient）、度值（Degree），以評估節點在網絡中的重要程度。

1.5 生物學過程與通路分析 利用Metascape數據庫對潛在治療靶點進行生物學過程與通路分析，將潛在治療靶點輸入數據庫，設置物種為人類進行分析，取P<0.05，得到生物學過程與通路分析結果。

1.6 潛在治療靶點靶點類型歸屬 利用DisGeNET（http：//www.disgenet.org/）數據庫對潛在治療靶點進行檢索，將潛在治療靶點依次輸入數據庫，獲取靶點類型信息（Protein Class）。

2 結果

2.1 薄荷中活性成分的篩選 通過TCMSP數據庫共獲得薄荷化學成分164個，根據口服生物利用度（OB）≥30%、類藥性（DL）≥0.18、化合物含量以及明確的生物活性報道，篩選出15個潛在的活性成分。詳見表1。

2.2 潛在治療靶點的預測 通過TCMSP數據檢索薄荷活性成分相關靶點，將這些靶點導入Uniprot數據庫，限定物種為人，進行靶點基因名稱的校正，去重后共得到57個靶點（其中Fortunellin、Linarin無相關作用靶點）。通過GeneCards數據庫，以“gallbladder”、“Chronic cholecystitis”為檢索關鍵詞，搜索得到慢性膽囊炎相關靶點，將活性成分作用靶點與疾病相關靶點進行匹配（見圖1），得到40個潛在治療靶點。

2.3 活性成分-作用靶點網絡構建 將薄荷活性成分和潛在治療靶點導入Cytoscape軟件構建活性成分-潛在治療靶點網絡圖，詳見圖2。圖中共涉及53個節點（13個化合物，40個潛在作用靶點，由于Fortunellin、Linarin無作用靶點，故在網絡中不體現），69條邊。不同的顏色和形狀代表薄荷活性成分和靶點，綠色菱形節點代表薄荷活性成分，藍色三角形代表潛在治療靶點，邊代表活性成分與潛在作用靶點之間的關聯。

2.4 蛋白互作網絡構建與分析 將上述作用靶點導入String數據庫，限定物種為人，獲取蛋白相互作用關系，以TSV格式保存其結果。保留node1、noe2、Combined score信息，將這三個信息導入Cytoscape軟件繪制蛋白相互作用網絡圖，見圖3，并進行網絡拓撲屬性分析，見表2。圖中節點表示靶點，邊表示靶點之間的聯系，由圖3可見，蛋白互作網絡共涉及38個節點，266條邊（其中PRSS1，CHRM3與其它靶點無相互作用，故沒有在網絡中體現）。節點的大小和顏色表示Degree值的大小，節點越大，顏色逐漸變深對應的Degree值越大。邊的粗細表示Combine score，邊越粗Combine score越大。經計算后可知，平均連接度約為14，平均最短路徑長度約為1.71，平均介數約為0.02，平均聚類系數約為0.7。具有高度值（連接度）和介數中心的靶點可被認為是中心靶點，在此網絡中，度值和介數中心均超過平均值的有10個，分別是EGFR、MYC、CASP3、CCND1、VEGFA、ERBB2、MDM2、ESR1、IL6、PPARG，可認為這10個是薄荷治療慢性膽囊炎的關鍵作用靶點。

2.5 生物學過程與信號通路分析 利用Metascape數據庫對潛在治療靶點進行生物學過程與信號通路通路分析，設定P<0.05，篩選靠前的生物過程，主要包括對類固醇激素的反應（response to steroid hormone）、對酸性化學物質的反應（response to acid chemical）、上皮細胞增殖（epithelial cell proliferation）、對銨離子的響應（response to ammonium ion）、血液循環（blood circulation）、細胞對過氧化氫的反應（cellular response to hydrogen peroxide）等。潛在治療靶點主要富集在13條信號通路，包括Pathways in cancer、prostate cancer、AGE-RAGE signaling pathway in diabetic complications、PI3K-Akt signaling pathway、Breast cancer、HIF-1 signaling pathway等信號通路。分析結果見圖4。

2.6 潛在治療靶點 靶點類型歸屬將40個潛在治療靶點依次導入DisGeNET數據庫，獲取其對應的類型，詳見表3。結果表明薄荷活性成分治療慢性膽囊炎過程中有信號分子、轉錄因子、受體、蛋白、酶等物質的參與。

3 結論與討論

薄荷具有保肝利膽的作用，是治療慢性膽囊炎的有效藥物，以其揮發油作為主要成分的藥物在治療膽囊相關疾病已有報道[5]。根據網絡藥理學的相關理念和技術，本研究對薄荷治療慢性膽囊炎作用機制進行了預測，利用TCMSP數據庫，并根據OB≥30%、DL≥0.18、化合物含量以及明確的生物活性報道篩選得到有效活性成分15種，獲取活性成分靶點，將其與慢性膽囊炎相關的靶點取交集，共得到40個潛在治療靶點，將潛在治療靶點作蛋白互作網絡分析，結果顯示EGFR、MYC、CASP3、CCND1、VEGFA、ERBB2、MDM2、ESR1、IL6、PPARG在網絡的中心位置，具有較高的Degree值和介數中心性，可能為薄荷治療慢性膽囊炎的關鍵靶點。表皮生長因子（EGFR）是原癌基因的一種表達產物，其表達部位在細胞質與細胞膜上，在慢性膽囊炎的組織中，EGFR的陽性表達率約為20%[15];c-Myc是MYC原癌基因族中的一員，c-Myc被異常激活后，其表達明顯升高，引起細胞增殖，同時抑制有關分化的基因表達，降低細胞的終末分化[16];IL6是炎癥性細胞因子，反應了機體對炎癥及感染時的反應狀態，而慢性膽囊炎患者的膽汁和血清中IL6呈現高表達狀態[17]。

潛在治療靶點涉及凋亡過程的負調控、RNA聚合酶II啟動子轉錄的正調控、神經元凋亡過程、積極調控成纖維細胞增殖等生物過程;核、基底外側質膜、細胞質等細胞組成;類固醇結合、染色質結合、轉錄因子活性，序列特異性DNA結合等分子功能。通路分析結果顯示，薄荷治療慢性膽囊炎的靶點主要涉及Pathwaysincancer、prostatecancer、AGE-RAGEsignalingpathwayindiabeticcomplications、PI3K-Aktsignalingpathway、Breastcancer、HIF-1signalingpathway等信號通路。

綜上所述，應用網絡藥理學的方法研究薄荷治療慢性膽囊炎的潛在作用機制，從而探明了薄荷在治療慢性膽囊炎的作用靶點及信號通路，并明確了薄荷通過多種活性成分對多種靶點發揮其治療慢性膽囊炎的作用機制，這為后續薄荷在慢性膽囊炎治療上的應用提供了方向。

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（收稿日期：2020-01-21 編輯：劉 斌）

基金項目：廣西自然科學基金青年項目（2018GXNSFBA294007）;廣西高校唐資源加工重點實驗室開放課題（2016TZYKF07）;柳州市科學研究與技術開發計劃課題（2017BA30203）。

作者簡介：孔麗（1998-），女，本科在讀，研究方向為中藥化合物成分基礎研究。E-mail：2331232050@qq.com

通信作者：吳春鳳（1982-），女，博士，副主任技師，研究方向為中醫內科基礎研究。E-mail：wuchunfengnet@163.com