不同分子量雙參多糖抗氧化活性研究

李彩藝　謝文靜　王福生

【摘 要】 目的：對不同分子量雙參多糖的抗氧化活性研究。方法：雙參經水提醇沉法、sevag法脫蛋白、大孔吸附樹脂脫色素得粗多糖，采用40%、60%、80%乙醇分級醇沉得到三個不同分子量的雙參多糖TGPA、TGPB和TGPC，利用HPGPC色譜分析三個不同醇沉部位的雙參多糖分子量。采用DPPH自由基和超氧陰離子自由基體系對其進行抗氧化活性評價。結果：TGP（A-C）分子量范圍在1600～2000 KDa、630～2000 KDa 和230～2000 KDa。TGPA主要的分子量為2000 KDa、TGPB主要分子量為691830KDa、TGPC主要分子量為575439KDa。不同分子量的雙參多糖體外抗氧化活性均呈濃度濃度依賴性，其中分子量小的雙參多糖具有較高的清除作用。結論：雙參多糖具有一定的抗氧化作用，為其進一步均一多糖的分離純化、結構表征和活性探索奠定基礎。

【關鍵詞】 雙參;多糖;抗氧化

【中圖分類號】R284 【文獻標志碼】 A【文章編號】1007-8517（2020）8-0034-03

Study on the Antioxidant Activity of Polysaccharides from ?Triplostegia glandulifera ?with Different Molecular Weight

LI Caiyi XIE Wenjing WANG Fusheng*

Collage of Pharmacy and Chemistry，Dali University，Dali 671000，China

Abstract：Objective To study the polysaccharides of ?Triplostegia glandulifera ?with different molecular weights.Methods The crude polysaccharides were obtained from ?Triplostegia glandulifera ?by water extraction and alcohol precipitation method，sevag method，decolorization by macroporous adsorption resin，and 40%，60%，and 80% ethanol fractionation and alcohol precipitation to obtain three ?Triplostegia glandulifera ?polysaccharides with different molecular weights，TGPA，TGPB and TGPC，HPGPC chromatography was used to analyze the molecular weight of ?Triplostegia glandulifera ?polysaccharides in three different alcohol precipitation sites.The DPPH and superoxide anion system were used to evaluate their antioxidant activity.Results The molecular weights of three different alcohol precipitation sites were in the range of 1600～2000 KDa、630～2000 KDa and 230～2000 KDa..The main molecular weight of TGPA is 2000 KDa，the main molecular weight of TGPB is 691830 KDa，and the main molecular weight of TGPC is 575439 KDa.The anti-oxidant activity of ?Triplostegia glandulifera ?polysaccharides with different molecular weights was concentration dependent in vitro，and the ?Triplostegia glandulifera ?polysaccharides with small molecular weights had a higher clearance effect.Conclusion ?Triplostegia glandulifera ?polysaccharides has certain antioxidant effects，which lays a foundation for its further structural characterization and activity exploration.

Key words： Triplostegia glandulifera ; Polysaccharide;Antioxidant

多糖是由10個及以上的單糖通過糖苷鍵連接而成的糖，屬于高分子化合物。研究表明許多植物多糖具有免疫調節、降血脂、降血糖、抗腫瘤等生物活性[1]。雙參（ Triplostegia glandulifera ）為川續斷科雙參屬植物，又稱蘿卜參、對對參、童子參、肚拉、土洋參和一支蒿等，主要產于云南、西藏、四川等地[2-3]，課題組前期對雙參小分子化合物進行了系列研究，尚未見文獻報道雙參多糖的研究。本課題旨在研究雙參不同分子量雙參多糖的抗氧化活性，以期為進一步研究雙參多糖結構與活性提供參考依據。

1 儀器與材料

1.1 儀器 HPLC-1260型高效液相色譜儀;FY135型中草藥粉碎機（天津泰斯特儀器有限公司）;湘立離心機TD5A-WS（湖南湘立科學儀器有限公司）;Shodex OHpak 804色譜柱（300 mm×7.5 mm）。

1.2 材料 右旋糖苷系列標準品180 Da（批號：140637-201203）、2500 Da（批號：140638-201203）、4600 Da（批號：140639-201203）、7100 Da（批號：140640-201203）、10000 Da（批號：140641-201203）、21400 Da（批號：140642-201203）、41100 Da（批號：140643-201203）、84400 Da（批號：140644-201203）、133800 Da（批號：140645-201203）、2000 kDa（批號：140646-201203）均購自中國食品藥品檢定研究院;1 mol/L Tis-Hcl緩沖液（批號：20190219，北京索萊寶公司）、DPPH（1，1-二苯基-2-苦基肼自由基，批號：ZZZQK-EE，梯希愛化成工業發展有限公司），水楊酸、H2O2、鄰苯三酚、VC均購自國藥集團化學試劑有限公司。

雙參植物于2017年10月采自于云南省大理州云龍縣五寶山，經大理大學段寶忠教授鑒定為川續斷科雙參屬植物雙參（ Triplostegia glandulifera ?Wall.）的地下根，植物樣本（編號：WFS-20171017）存放于大理大學藥學與化學學院王福生教授課題組。

2 方法

2.1 提取與分離 取雙參塊根進行干燥（50 ℃恒溫干燥），利用粉碎機粉碎雙參塊根至80目篩制成干粉備用。稱取干燥的雙參粉末1 Kg，加入95%乙醇2 L冷浸過夜，棄上清，濾出藥渣，加入2 L蒸餾水置于索式提取器中加熱回流，每次2 h，此操作重復三次，合并續濾液，經減壓濃縮后利用Sevag法去除蛋白，萃取后上層為蛋白質層，棄去，濃縮下層濾液成浸膏200 g溶解至蒸餾水中通過AB-8大孔吸附樹脂柱層析脫去色素等小分子雜質，依次采用蒸餾水、30%甲醇-水和60%甲醇-水洗脫劑洗脫。以苯酚硫酸法監測合并具有同一峰型的洗脫成分即得雙參粗多糖，將雙參粗多糖減壓濃縮至600 mL。采用分步醇沉的方法，依次加入無水乙醇至醇沉濃度分別為 40%，60%和80%，置4 ℃冰箱內過夜。3500 rpm離心10 min，沉淀冷凍干燥分別得不同分子量的雙參多糖TGPA、TGPB和TGPC。

2.2 不同分子量雙參多糖相對分子質量測定

2.2.1 色譜條件 色譜柱：Shodex OHpak 804（300 mm×7.5 mm）;流動相：超純水;濃度：標準品及樣品質量濃度均為1 mg/mL;進樣量：10 μL;體積流量：0.5 mL/min;柱箱溫度：35℃;氮氣流速：1.3 mL/min，蒸發光檢測器蒸發溫度：55℃;霧化溫度：45℃。

2.2.2 含量測定 將右旋糖酐標準品180、2500、4600、7100、10000、21400、41100、84400、133800 Da、2000 KDa依次進樣，測定保留時間。以相對分子質量對數（log Mw）為縱坐標保留時間（tR）為橫坐標繪制標準曲線。根據線性回歸方程計算樣品的Mw。

2.3 清除DPPH活性作用的測定 精密稱取DPPH粉末0.0128 g于50 mL容量瓶加入無水甲醇定容至刻度線，配制成0.65 mmol/L的DPPH-甲醇溶液，將多糖溶液配制成濃度為0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mg/mL的樣品溶液，向96孔板中加入50 μL不同濃度的樣品溶液，每個樣品濃度設5個復孔，再向各孔中加入150 μL DPPH甲醇溶液，以相同濃度的Vc溶液作陽性對照組，蒸餾水作空白對照，于室溫黑暗處放置30 min后，酶標儀517 nm波長處測定吸光度值。根據公式1計算TGPA、TGPB和TGPC的清除率。

公式1=（A_blank-A_sample）/A_blank

2.4 清除超氧陰離子作用測定 按照 Kao 等方法[4]，將多糖溶液配制成濃度0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mg/mL的樣品溶液。取10 mL試管加入1 mL多糖溶液，依次向試管中加入0.05 mol/L Tis-HCl（pH=8.2）4.5 mL，25 mmol/L鄰苯三酚0.4 mL，于25℃水浴反應5 min后，加入8 mmol/L HCl 1 mL終止反應，以相同濃度的Vc作陽性對照組，蒸餾水作空白對照組。于299 nm處測定吸光度值，根據公式2計算不同醇沉濃度多糖對超氧陰離子的清除率。

公式2=（A_blank-A_sample）/A_blank

3 結果

3.1 相對分子量的測定 根據系列不同分子量系列的標準品，按照相對分子質量對數（log Mw）為縱坐標;保留時間（tR）為橫坐標繪制標準曲線，得曲線方程式為： y=-0.3491x+9.9531，R2=0.994 。根據高效凝膠出峰時間（圖2所示）可知TGPA分子量范圍為1600～2000 KDa ;TGPB分子量范圍為630～2000 KDa ;TPGC分子量范圍為230～2000 KDa。其中TGPA主要的分子量為2000 KDa、TGPB主要為 691830KDa、 TGPC主要為575439KDa。如圖1所示。

3.2 抗氧化活性 由圖2可知，TGP-（A-C） 對DPPH和超氧陰離子的清除作用結果顯示：在不同濃度下TGPA、TGPB和TGPC均對DPPH自由基和超氧陰離子均有一定的清除作用，其清除能力呈濃度依賴性。不同分子量的雙參多糖對DPPH的清除作用效果沒有太大的差距。而對于超氧陰離子的清除作用中，TGPC清除超氧陰離子的效果最為顯著。TGPA和TGPB對超氧陰離子的清除也有一定的效果，其中TGPA的清除效果最弱。

4 結論

近年來，隨著多糖研究的不斷深入，發現植物多糖具有很多良好的生物活性。例如抗腫瘤、抗疲勞、降血糖等生物活性。而對雙參多糖的研究尚未見其報道。本實驗將雙參多糖經水提醇沉、Sevag法脫蛋白、AB-8大孔吸附樹脂柱分離，分步醇沉得到不同分子量的雙參多糖。以蒸餾水作流動相，蒸發光檢測器檢測，采用不同分子量標準品建立標準曲線，從而確定雙參多糖的分子量。理論上，分步醇沉中，低體積分數的乙醇溶液沉淀下來的雙參多糖相對分子質量越大，而上清液部分則是相對分子質量小的雙參多糖或寡糖，隨著醇沉的次數增多，沉淀體積越來越少，離心后依舊存在少量沉淀部分存在上清液中，導致分子量存在交叉。由于交叉存在量很少可忽略不計。綜合藥理活性結果表明：不同分子量段的雙參多糖均對DPPH體系和超氧陰離子體系具有清除作用，TGPA、TGPB和TGPC對DPPH的清除作用遠遠低于Vc的清除作用，而對超氧陰離子的清除作用中可以看出TGPC的清除作用遠大于TGPA和TGPB雙參多糖，當濃度達到1 mg/mL時清除超氧陰離子的作用與抗壞血酸作用相當。從而可以進一步推測在TGPC雙參多糖具有更好的清除作用，繼而為雙參均一多糖的分離純化、結構表征、藥理活性及其作用機制的進一步研究提供了基礎材料。

參考文獻

[1]徐翠蓮，杜林洳.多糖的提取、分離、純化及分析鑒定方法研究[J].河南科學，2009，27（12）：1524-1526.

[2]何銀堂，胡作亮.本草名釋與傳說[M].北京：中國中醫藥出版社，1998.

[3]大理白族自治州人民政府.大理中藥資源志[M].昆明：云南民族出版社，1991.

[4]KAO T H，CHEN B H.Functional components in soybean cake and their effects on antioxidant activity[J].J Agric Food Chem，2006，54（20）： 7544-7555.

（收稿日期：2020-01-10 編輯：劉 斌）

基金項目：國家自然科學基金（31860098）。

作者簡介：李彩藝（1994-），女，漢族，碩士研究生在讀，研究方向為天然藥物化學。E-mail： lcytianhua@163.com

通信作者：王福生（1965-），男，白族，博士，教授，研究方向為天然藥物化學。E-mail： wfsyn@163.com