阿托伐他汀對血管緊張素Ⅱ誘導的心房肌細胞結締組織生長因子及縫隙連接蛋白43表達的影響

雷光濤 何力鵬 黃鐵球 吳延慶 吳清華 程曉曙 姜 宇

(南昌大學第二附屬醫院心血管內科，江西 南昌 330006)

?

阿托伐他汀對血管緊張素Ⅱ誘導的心房肌細胞結締組織生長因子及縫隙連接蛋白43表達的影響

雷光濤 何力鵬1黃鐵球 吳延慶 吳清華 程曉曙 姜 宇

(南昌大學第二附屬醫院心血管內科，江西 南昌 330006)

目的 探討阿托伐他汀對血管緊張素(Ang)Ⅱ誘導的心房肌細胞結締組織生長因子(CTGF)和縫隙連接蛋白(Cx43)表達的影響。方法 將雄性Wistar大鼠40只隨機分為A組(15只，給予0.9%氯化鈉溶液)、B組(12只，給予鹽酸異丙腎上腺素)和C組(13只，給予鹽酸異丙基腎上腺素+阿托伐他汀鈣片)。分別用放射免疫法測定AngⅡ濃度，凝膠成像系統分析轉化生長因子(TGF)-β mRNA、CTGF和Cx43 mRNA的表達。結果 三組大鼠血漿和心肌AngⅡ水平均有統計學差異(P<0.05)，B組大鼠血漿和心肌AngⅡ水平均高于A組(P<0.05)，C組與A組無統計學差異(P>0.05)。三組大鼠TGF-β1 mRNA、CTGF和Cx43 mRNA表達水平均有統計學差異(P<0.05)，B組大鼠TGF-β1 mRNA、CTGF和Cx43 mRNA表達水平均高于A組(P<0.05)，C組與A組無統計學差異(P>0.05)。結論 阿托伐他汀能夠降低AngⅡ誘導的心房肌細胞CTGF和Cx43 mRNA表達，減輕與CTGF和Cx43 mRNA表達相關的心肌纖維化和心臟重構進展，在房顫的預防和治療中具有一定的臨床意義。

血管緊張素Ⅱ；結締組織生長因子；縫隙連接蛋白43；阿托伐他汀

阿托伐他汀具有抗炎、抗氧化、降脂、抑制細胞外基質(ECM)聚集等作用，已在心血管病的治療中廣泛應用〔1〕。結締組織生長因子(CTGF)能夠加快多種活細胞的分裂增殖、上調ECM含量、促進組織纖維化，參與皮膚再生、腫瘤細胞分化、瘢痕形成、器官纖維化、肌肉代謝等多個病理生理和代謝過程〔2〕。心房肌細胞縫隙連接蛋白(Cx)43能夠影響細胞沖動傳導，進而影響心臟電生理，促進心房重構〔3〕。研究發現，血管緊張素(Ang)Ⅱ能夠通過Rao蛋白系統上調CTGF和Cx43的表達，而阿托伐他汀能夠通過抑制AngⅡ表達影響CTGF和Cx43的表達〔4〕。本實驗擬探討阿托伐他汀對CTGF和Cx43表達的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與試劑 雄性Wistar大鼠40只，體重40～45 g，由上海斯萊克實驗動物有限責任公司提供。多克隆抗體、單克隆抗體β-actin均購自美國Santa Cruz生物科技公司；DMEM干粉培養基、胰蛋白酶、牛血清、Ⅱ型膠原酶均購自美國Gibco公司；免疫組化染色試劑盒購自北京中杉金橋公司；總RNA提取試劑盒和PCR試劑盒均購自北京天根生化科技有限公司。

1.2 誘導分組 使用計算機隨機數生成器將40只大鼠分為三組。A組(15只)：給予0.9%氯化鈉溶液；B組(12只)：給予鹽酸異丙腎上腺素(華潤雙鶴藥業股份有限公司，批準文號：國藥準字H11021929)；C組(13只)：給予鹽酸異丙腎上腺素+阿托伐他汀鈣片(北京嘉林藥業股份有限公司；批準文號：國藥準字H20093819)。

1.3 心房肌細胞培養 大鼠仰臥位固定，打開胸腔，取胸壁組織去血、冷磷酸鹽緩沖液(PBS)清洗，將心房肌剪成肌粒。加入胰酶(濃度為0.08%)、常溫水浴10 min。加入混合酶水浴消化，收集上清液，添加DMEM/F12終止消化、洗細胞、制作單細胞懸液，接種于培養皿培養。

1.4 免疫組織染色 培養細胞1 d后，使用多聚甲醛(4%)固定30 min，在H2O2(30%)1份+純甲醇50份混合液浸泡、滅活，蒸餾水洗滌。牛血清白蛋白(BSA)封閉液，去除多余液體。滴加兔抗大鼠α-橫紋肌肌動蛋白一抗工作液，PBS液清洗。添加羊抗兔二抗，20 min，PBS液清洗。二氨基聯苯胺(DAB)常溫顯色，脫水、透明后封片。

1.5 AngⅡ測定 在液氮中研磨心房肌組織，加入PBS液(0.05 mol/L，pH7.4)5 ml、二巰基丙醇(0.32 mol/L)10 μl、8-羥基喹啉硫酸鹽(0.34 mol/L)20 μl，離心(2 000 r/min)10 min取上清液。采用放射免疫法測定血漿和心肌AngⅡ水平。

1.6 轉化生長因子(TGF)-β1、CTGF和Cx43測定 采用Trizol試劑盒提取細胞總RNA，依據試劑盒說明進行逆轉錄反應。以各自引物擴增TGF-β1、CTGF和Cx43，引物見表1。擴增條件：95℃預變性5 min，然后95℃45 s，55℃1 min，72℃1 min，循環40次，72℃8 min。取PCR產物進行瓊脂糖凝膠電泳，采用凝膠成像系統分析mRNA表達水平。

表1 各基因引物序列及擴增片段長度

基因引物序列片段長度TGF-β1正義鏈:5'-AGGTAACGCCAGGAATTGTTGCTA-3'反義鏈:5'-TGCGCCTGCAGAGATTCAAG-3'79bpCTGF正義鏈:5'-CCTGACCCAACTATGATGC-3'反義鏈:5'-CCCTTACTCCCTGGCTTT-3'200bpCx43正義鏈:5'-AGAATCATAGCGTCGGTGTCAGG-3'反義鏈:5'-GCTGGTATTTGGATGGCTGAAGA-3'82bp

1.7 統計學方法 應用SPSS16.0軟件，定量資料多組間差異性分析采用方差分析，多組間的兩兩比較采用LSD檢驗。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 三組大鼠AngⅡ水平比較 三組大鼠血漿和心肌AngⅡ水平均有統計學差異(P<0.05)。B組大鼠血漿和心肌AngⅡ水平均高于A組(P<0.05)，C組與A組無統計學差異(P>0.05)。見表2。

組別n血漿心肌A組15503.65±9.5760.41±1.37B組12517.73±8.571)61.6±1.051)C組13506.77±14.8960.9±0.06F/P值-5.860/0.0064.566/0.017

與A組比較:1)P<0.05；下表同

2.2 三組大鼠TGF-β1、CTGF和Cx43 mRNA表達水平比較 三組大鼠TGF-β1、CTGF和Cx43 mRNA表達水平均有統計學差異(P<0.05)。B組大鼠TGF-β1、CTGF和Cx43 mRNA表達水平均高于A組(P<0.05)，C組與A組差異無統計學意義(P>0.05)。見表3。

組別nTGF-β1CTGFCx43A組150.28±0.060.42±0.030.95±0.05B組120.38±0.071)0.47±0.041)1.01±0.061)C組130.31±0.080.44±0.050.95±0.03F/P值-6.920/0.0034.697/0.0154.870/0.013

3 討 論

CTGF基因位于6q23.1，在人體眾多組織器官中廣泛表達。CTGF的表達受多種細胞因子的調控，如AngⅡ、血管內皮生長因子、TGF-β、胰島素樣生長因子-1、糖基化終產物等，以及機械應力、靜水壓和氧化應激等均能刺激CTGF〔5〕。作為GTGF的上游因子，二聚多肽類生長因子TGF-β1具有多種生物學效應，在組織纖維化過程中發揮重要作用。TGF-β1是CTGF調控最重要的通路，通過Smad信號通路、Ras/MEK/ERK1/2通路誘導CTGF的表達〔6〕。CTGF通過和多種生長因子結合發揮不同的生物學效應〔7〕：(1)生長與分化：CTGF能夠上調cAMP水平，加速細胞分裂和增殖；(2)細胞黏附與趨化：CTGF通過結合ECM促進細胞黏附，具有促進成纖維細胞向纖連蛋白黏附的作用；(3)細胞凋亡：CTGF能夠增強caspase23活性，降低平滑肌細胞活性，促進細胞凋亡；(4)平衡ECM穩態：CTGF能夠促進層黏蛋白、糖蛋白膠原的生成，誘導膠原表達，抑制ECM降解酶的活性，促進纖維化；(5)促血管生成。相關研究發現〔8〕，敲除CTGF基因的小鼠表現出血管缺陷，表明CTGF是促血管形成因子。Cx蛋白以端端連接的方式分布在心房肌細胞中，與心臟電激動傳導各向異性和方向密切相關。心肌間質纖維化會影響縫隙連接的大小、數量和分布，進而影響細胞間的傳導作用。細胞外調節激酶、鈣調神經磷酸酶、鈣網蛋白、AngⅡ、TGF-β1等信號傳導因子構成的信號網絡均能夠調節Cx43的磷酸化，影響Cx43裝配、含量、分布與傳導，影響縫隙連接重構。

研究發現，他汀類藥物除了具有調脂功效外，還能抑制氧化反應、抑制炎癥反應、減少組織膠原含量、提高內皮細胞功能、促進斑塊穩定等〔9〕。臨床研究和動物實驗均表明〔10〕，他汀類藥物能夠改善心肌的纖維化和心室重構。Riser等〔11〕研究發現，他汀類藥物能夠降低CTGF表達，減輕腎間質的纖維病變。Abraham等〔12〕在對肥厚性心肌病白兔研究中發現，他汀類藥物能夠減輕心肌肥厚和心肌纖維化。Rakotoniaina等〔13〕研究發現，阿托伐他汀能夠改善心臟供血、減緩心室重構。他汀類能夠抑制AngⅡ的表達、降低ACE活性，減少NO生成，保護心房肌細胞，改變縫隙連接重構。

本研究結果發現，大鼠血漿和心肌AngⅡ水平先增高，使用阿托伐他汀后下降，基本恢復到對照組水平，說明阿托伐他汀能夠降低血漿和心肌AngⅡ水平。其可能機制是：阿托伐他汀通過抑制異戊烯化進程，阻止小分子單體G蛋白激活，進而降低AngⅡ受體表達〔14〕。TGF-β1、CTGF和Cx43 mRNA表達水平改變與AngⅡ受體表達水平趨勢一致，AngⅡ受體表達較高者TGF-β1、CTGF和Cx43 mRNA表達也相對較高。其可能機制如下：AngⅡ通過激活TGF-β1生物活性途徑或Rao蛋白系統途徑增加CTGF表達，介導心肌纖維化。 隨著AngⅡ水平升高，有絲分裂原活化蛋白激酶信號分子(如JNK、P38、ERK等)使得Cx43肽鏈發生多位點磷酸化，Cx43合成增加；AngⅡ增加促進Ca2+內流，激活蛋白酶Calpains和鈣調神經磷酸酶、釋放溶酶體、破壞細胞亞結構，增加Cx43的降解，最終使得Cx43合成減少〔15〕。阿托伐他汀能夠降低AngⅡ誘導的TGF-β1、CTGF和Cx43 mRNA表達。

1 梁 敏，王 琴.阿托伐他汀聯合曲美他嗪治療不穩定型心絞痛療效觀察〔J〕.遼寧醫學院學報，2014；35(6)：22-4.

2 李瑞芳，方偉進，曹珊珊，等.阿托伐他汀對心肌纖維化影響的實驗研究及其作用機制〔J〕.中國臨床藥理學雜志，2014；30(7)：594-6，606.

3 Benova T，Knezl V，Viczenczova C，etal.Acute anti-fibrillating and defibrillating potential of atorvastatin，melatonin，eicosapentaenoic acid and docosahexaenoic acid demonstrated in isolated heart model〔J〕.J Physiol Pharmacol，2015；66(1)：83-9.

4 閆 晗，劉淑華，黃紅春，等.阿托伐他汀對高血壓大鼠腎臟CTGF表達的影響〔J〕.微循環學雜志，2009；19(2)：5-7，10.

5 Hao G，Han Z，Meng Z，etal.Ets-1 upregulation mediates angiotensin II-related cardiac fibrosis〔J〕.Int J Clin Exp Pathol，2015；8(9)：10216-27.

6 李英楠，張 鸝，呂海濤，等.阿托伐他汀對腹膜透析大鼠腹膜纖維化的影響及機制探討〔J〕.山東醫藥，2014；54(24)：25-7.

7 涂書玎.CTGF和CD34在退變的大鼠尾椎間盤中的表達及相關性分析〔D〕.衡陽：南華大學，2014.

8 曹 蕾.阿托伐他汀對糖尿病心肌病大鼠心功能保護作用的實驗研究〔D〕.南京：東南大學，2012.

9 Zhu B，Ma AQ，Yang L，etal.Atorvastatin attenuates bleomycin-induced pulmonary fibrosis via suppressing iNOS expression and the CTGF (CCN2)/ERK signaling pathway〔J〕.Int J Mol Sci，2013；14(12)：24476-91.

10 周迪軍.阿托伐他汀聯合替米沙坦對糖尿病腎病患者血清TGF-β1、CTGF的影響〔J〕.醫學臨床研究，2013；30(7)：1407-8，1409.

11 Riser BL，Denichilo M，Cortes P，etal.Regulation of connective tissue growth factor activity in cultured rat mesangial cells and its expression in experimental diabetic glomerulosclerosis〔J〕.J Am Soc Nephrol，2000；11(1)：25-38.

12 Abraham SS，Osorio JC，Homma S，etal.Simvastatin preserves cardiac function in genetically determined cardiomyopathy〔J〕.J Cardiovasc Pharmacol，2004；43(3)：454-61.

13 Rakotoniaina Z，Guerard P，Lirussi F，etal.Celecoxib but not the combination of celecoxib+atorvastatin prevents the development of monocrotaline-induced pulmonary hypertension in the rat〔J〕.Naunyn Schmiedebergs Arch Pharmacol，2008；378(3)：241-51.

14 Sriramula S，Francis J.Tumor necrosis factor-alpha is essential for angiotensin Ⅱ-induced ventricular remodeling：role for oxidative stress〔J〕.PLoS One，2015；10(9)：e0138372.

15 Du CQ，Liu XW，Zeng GZ，etal.Inhibition of farnesyl pyrophosphate synthase attenuates angiotensin Ⅱ-induced fibrotic responses in vascular smooth muscle cells〔J〕.Int J Mol Med，2015；35(6)：1767-72.

〔2015-12-15修回〕

(編輯 袁左鳴)

2014年省級第二批科技專項項目(No.20142BAB205042)

1 江西省武警總隊醫院心內科

姜 宇(1975-)，男，碩士，副主任醫師，主要從事動脈粥樣硬化病變、冠心病介入治療方面的研究。

雷光濤(1984-)，男，碩士，主治醫師，主要從事動脈粥樣硬化病變方面的研究。

R54

A

1005-9202(2016)23-5822-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2016.23.021