蘭州百合多酚提取工藝優化研究

（靜寧縣食品藥品檢驗檢測中心，甘肅 靜寧 743400）

植物多酚是植物體內廣泛存在的一種芳香族羥基衍生物的總稱，其數量龐大，迄今已知的酚類物質已有8 000種以上[1]。由于其結構復雜、化學活性顯著且存在形態多樣，因而多酚類物質的研究進展十分緩慢[2]。20世紀中期以后，植物多酚與多種生物活性物質的化學反應及其抗氧化、清除自由基等一系列優越功能被逐步發現，研究人員也開始重視這一研究領域[3]。百合是一種有較高營養保健價值的蔬菜，有極高的食用價值。蘭州百合含糖量高，粗纖維少，肉質細膩，還含有許多有益成分[4]，其中多酚含量就相當可觀[5]。

多酚是多羥基化合物，其結構特點決定多酚易溶或可溶于水、醇類、醚類、酮類等。目前，關于蘭州百合多酚提取工藝的方法主要有溶劑提取法、微波輔助提取法、超聲波輔助提取法、生物酶解提取法等[6-7]。有機溶劑提取法常用的溶劑有甲醇、乙醇、丙酮等，此法有提高多酚得率、縮短提取反應時間等優點。本試驗采用有機溶劑提取法對蘭州百合多酚的提取工藝進行研究，通過正交試驗設計篩選最優工藝參數，以期為蘭州百合多酚的提取開辟一條具有工業開發前景的新途徑。

1 材料和方法

1.1 材料與試劑

蘭州百合干自蘭州天順百合商貿有限公司采購，粉碎后過0.15 mm篩，備用；乙醇、無水碳酸鈉、丙酮、甲醇、乙醇、鹽酸、氫氧化鈉均為國產分析純，福林酚、沒食子酸購自北京市索萊寶科技有限公司。

1.2 儀器與設備

UV-2501PC型紫外-可見分光光度儀（日本島津公司）；DK-98-1型電熱恒溫水浴鍋，FW80型高速萬能粉碎機（天津市泰斯特儀器有限公司）；IKAMAG RCT型磁力加熱攪拌器（德國IKA-Werke公司）。

1.3 試驗方法

1.3.1 單因素影響試驗

分別考查溶劑類型、料液比、溶劑體積分數、超聲功率、提取溫度和提取液pH值等單因素對蘭州百合多酚得率的影響，試驗方法如下：

溶劑種類因素試驗：稱取一定量蘭州百合粉末，按照1∶30比例分別加入體積分數均為90%的甲醇、乙醇、丙酮溶液，采用1 mol/L HCl或NaOH調節溶液pH值為7，在溫度為40 ℃條件下提取25 min后，在2 000 r/min離心10 min后收集上清液，測定蘭州百合多酚含量，每組3個重復。

料液比因素試驗：準確稱取相同批次的蘭州百合各1.0 g，按照料液比（1∶15、1∶20、1∶25、1∶30、1∶35，g/mL）加入濃度為90%的乙醇溶劑，溶液pH值為7，在超聲功率500 W，溫度40 ℃下，提取25 min后，分別離心并收集提取液，定容至100 mL，測定各處理蘭州百合多酚得率，每處理3次重復。

溶劑體積分數因素試驗：準確稱取相同批次的蘭州百合各1.0 g，按照1∶30比例加入不同濃度的乙醇溶劑（60%、70%、80%、90%、100%），溶液pH值為7，在超聲功率500 W，溫度40 ℃條件下提取25 min后，分別離心并收集提取液，定容至100 mL，測定各處理蘭州百合多酚得率，每處理3次重復。

超聲功率因素試驗：準確稱取相同批次的蘭州百合各1.0 g，各加入濃度為90%的乙醇溶劑，溶液pH值為7，在不同超聲功率（400、500、600、700、800 W），溫度40 ℃條件下，提取25 min后，分別離心并收集提取液，定容至100 mL，測定各處理蘭州百合多酚得率，每處理3次重復。

提取溫度因素試驗：準確稱取相同批次的蘭州百合各1.0 g，按照1∶30比例分別加入濃度為90%的乙醇溶劑，溶液pH值為7，在超聲功率500 W，不同溫度（30、40、50、60、70 ℃）下，提取25 min后，分別離心并收集提取液，定容至100 mL，測定各處理蘭州百合多酚得率，每處理3次重復。

提取液pH值因素試驗：準確稱取相同批次的蘭州百合各1.0 g，分別加入濃度為90%的乙醇溶劑，調節溶液pH值（5、6、7、8、9），在超聲功率500 W，溫度40 ℃下，提取25 min后，分別離心并收集提取液，定容至100 mL，測定各處理蘭州百合多酚得率，每處理3次重復。

1.3.2 多酚提取正交試驗設計

在單因素試驗基礎上進行L9（34）正交試驗，乙醇濃度（A）設3個水平：80%、90%、100%；提取溫度（B）設3個水平：30、40、50℃；pH值（C）設3個水平：6、7、8；超聲功率（D）設3個水平：400、500、600 W。

1.3.3 最優條件的驗證試驗

將正交試驗獲得的最優條件進行3次重復試驗，計算蘭州百合多酚平均得率。

1.4 多酚得率測定方法

多酚質量濃度：稱取0.1 g沒食子酸，加入100 mL蒸餾水，制備1.0 mg/mL沒食子酸溶液[8]。分別取0.05、0.10、0.15、0.20、0.25、0.30 mL至50 mL容量瓶中，加入2 mL福林酚試劑搖勻，靜置5 min，滴加4 mL質量分數10%碳酸鈉溶液，置于25 ℃的恒溫水浴鍋中，顯色2 h后在760 nm波長處測定吸光度，以多酚質量濃度（以沒食子酸計）為橫坐標，吸光度為縱坐標繪制標準曲線，得到多酚的標準曲線方程：y＝1.958 8x＋0.059 1，式中：y為所對應的吸光度；x為多酚質量濃度（以沒食子酸計，mg/mL）；相關系數r2＝0.999 1，表明該回歸方程的擬合度高，可準確計算多酚質量濃度。

多酚得率：取蘭州百合提取液全部，定容至100 mL，取待測液0.5 mL，加入0.5 mL蒸餾水，再加入福林酚0.2 mL，反應3～8 min，再加入飽和碳酸鈉溶液1 mL，黑暗反應1 h，再用蒸餾水定容至5 mL，在760 nm波長處測定吸光度。由標準曲線得到提取液中多酚質量濃度，并計算多酚得率（ω）。

ω（mg/g）＝10x×M×n×V×2 ，式中：x為多酚質量濃度（mg/mL）；M為蘭州百合質量（g）；n為稀釋倍數；V為提取液體積（mL）。

1.5 數據分析方法

所有試驗結果分為3組，結果數據均取平均值。使用Excel 2007進行方差分析（ANOVA）評估統計顯著性。

2 結果與分析

2.1 單因素影響試驗結果

2.1.1 溶劑種類對蘭州百合多酚得率的影響

目前多酚提取試驗一般采用有機溶劑斷裂氫鍵來產生多酚，不同的溶劑對植物多酚提取率有不同的影響[9]。乙醇是最常用的工業提取劑，其價格低廉，安全性高，有利于清潔生產，來源廣泛，且對人體無毒害作用。由圖1可知，隨著水浴時間的增加，蘭州百合多酚得率越來越高，其中，乙醇的提取效果最好。故選擇乙醇作為蘭州百合多酚的提取溶劑進行后續工藝優化試驗。

2.1.2 料液比對蘭州百合多酚得率的影響

多酚與溶劑間的濃度差是多酚提取的推動力，選擇適宜的料液比，不僅有利于提高多酚傳質速率和多酚得率，還能降低溶劑消耗與生產成本[10]。由圖2可知，蘭州百合多酚得率隨提取溶劑用量增大而逐漸升高，當料液比達到1∶30（g/mL）后，多酚得率達到最大值。這是由于蘭州百合多酚已大部分溶出，繼續增加溶劑用量效果不再顯著，反而會造成溶劑損耗；因此，后續試驗確定為1∶30。

2.1.3 乙醇濃度對蘭州百合多酚得率的影響

多酚通常與植物大分子物質以氫鍵等形式結合形成穩定化合物，一般采用有機溶劑斷裂氫鍵來產生多酚，不同溶劑體積分數對多酚得率影響也較大[11]。由圖3可知，多酚得率隨著乙醇體積分數的升高而增大，當乙醇濃度為90%時提取效果最好。分析乙醇溶液體積分數的變化規律，當溶劑用量過低時，極性過強，導致糖類等水溶性物質萃出量增大，對蘭州百合的提取有較大影響；若采用無水乙醇則造成極性太低，達不到斷裂化學鍵的目的。

另外，提取時間對目標物質的生產周期和效率影響較大，不同提取時間也同樣影響著多酚得率。由圖3可知，采用90%乙醇在提取開始20 min內，蘭州百合多酚得率逐漸增高，在20 min時達到最大值，之后趨勢比較平緩。這可能是由于蘭州百合中的多酚類在最初的20 min內就已基本提取完成，隨著提取時間的延長，可溶出的多酚類物質越來越少。

2.1.4 超聲功率對蘭州百合多酚得率的影響

超聲波振蕩可以破壞植物細胞的細胞壁，增加提取率。從圖4可以看出，超聲功率的大小對試驗結果具有一定的影響，隨著超聲功率的增加，多酚得率出現先增大后下降的趨勢；因此，選擇500 W作為多酚提取的最佳超聲功率。從圖4還可得出，隨著超聲提取時間的延長，多酚通過超聲破碎逐漸溶出，并在20 min基本達到最大，20 min以后多酚得率基本沒有變化，所以超聲提取時間延長對多酚的提取并沒有好處，反而對細胞內物質有一定破壞，增加目標產物的提取難度。

2.1.5 提取溫度對蘭州百合多酚得率的影響

較高的處理溫度可加快分子運動及傳質速率，但溫度過高將導致多酚中的熱不穩定性成分產生氫化而被破壞[11]。由圖5可知，在30～50 ℃范圍內，多酚的提取速率最大，其中在40 ℃下提取20 min時多酚得率最大，達到87.59 mg/g；當溫度高于40 ℃時多酚得率逐漸下降，這可能是由于多酚類物質在高溫條件下易被氧化，部分多酚類物質結構發生改變所致。

2.1.6 提取液pH值對蘭州百合多酚得率的影響

適宜的酸度可增加植物組織細胞的通透性，并抑制多酚氧化酶的活性，這不僅有利于有效成分的溶出，還減小了酶促氧化反應的產生，均可提高多酚得率。由圖6可知，當提取液pH值為7時，多酚得率最佳，由此可知，蘭州百合多酚的提取液最佳pH值為7。

2.2 正交試驗結果及驗證試驗

在上述單因素試驗基礎上，又對蘭州百合多酚提取進行了正交試驗設計，表1結果表明：影響多酚提取的因素由強到弱依次為A＞B＞C＞D，分別是乙醇濃度＞提取溫度＞pH值＞超聲功率；由此可見，提取溫度、乙醇濃度對蘭州百合提取多酚的影響較大，最優的工藝組合為A1B2C2D2，即最佳提取工藝參數組合為乙醇濃度為80%、提取溫度為40 ℃、提取液pH值為7、超聲功率為500 W。

在上述最優工藝組合基礎上進行3次驗證試驗，得到蘭州百合多酚平均得率為100.27 mg/g。

由方差分析結果可知，乙醇濃度、提取溫度和提取液pH值3因素的F值＞P值，說明對蘭州百合提取多酚的影響具有一定意義。

表1 蘭州百合多酚提取L9（34）正交試驗結果

3 結論與討論

本試驗采取正交試驗設計對蘭州百合中多酚的提取條件進行了優化研究，在單因素試驗確定了溶劑種類基礎上，當繼續增加料液比時，多酚得率增加不顯著，考慮后期工業化應用時料液比增加會增大生產成本，所以確定為1∶30，故選擇乙醇濃度、提取溫度、提取液pH值和超聲功率4因素進行優化正交試驗設計，以獲得較佳提取條件。L9（34）正交試驗結果表明，影響多酚提取的因素分別是乙醇濃度＞提取溫度＞pH值＞超聲功率，最佳提取工藝參數組合為乙醇濃度80%、提取溫度40 ℃、提取pH值為7、超聲功率為500 W。在最優工藝組合基礎上進行3次驗證試驗，得到蘭州百合平均多酚得率為100.27 mg/g，可以為蘭州百合多酚提取工廠化深入研究提供一定依據。

當然，影響蘭州百合多酚得率提取的因素有很多。例如，在蘭州百合種植過程中，其多酚含量會受到品種[12]、氣候[13]、季節[14]、產地[15]、肥水管理[16]因素的影響；在蘭州百合收獲過程中、收獲后的保藏方式以及烘干方式也會影響多酚的含量；在試驗過程中，其粉末顆粒度的大小以及提取方法同樣都會影響多酚的提取。這些因素對蘭州百合中多酚提取的影響還有待于進一步研究加以確定。